宁夏回族自治区自然科学基金(NZ0505)
- 作品数：7 被引量：41H指数：2
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- 新型rPA(K)原核表达载体的构建及初步表达
- 2008年
- 利用PCR技术,获得了rPA(K)cDNA片段,将其克隆至pET-30a(+),成功构建了新型的rPA(K)原核载体pLrA(K),并实现了其在大肠杆菌中的初步表达,经IPTG(终浓度为1 mmol/L)分别于37℃诱导1,2,3 h后,以Bio-Rad凝胶成像仪分析目的蛋白,相对含量分别是19%,15.8%和24.3%,平均密度分别是0.13,0.14和0.16,IPTG诱导3 h后蛋白表达量最高.ELISA结果显示表达产物与抗t-PA抗体呈现特异性阳性反应,进一步参考标准曲线得出样品中rPA(K)的平均含量为210μg/L.
- 罗惠霞李敏王玉炯李稷亮
- 关键词：组织型纤溶酶原激活剂RPA(K)原核表达
- rPA(K)的原核表达及其产物的初步纯化
- 2007年
- rPA(K)是经过缺失/定点突变技术所获得的t-PA突变体。本实验以IPTG诱导,实现了rPA(K)在原核系统中的表达。实验证明目的产物的表达形式为包涵体,且当以IPTG诱导3h时,表达量最高,为41%。此后对该表达产物进行了初步纯化,即通过对不同超声破碎次数,包涵体洗涤液(脲,Triton X-100,乙醇)的不同浓度对纯化的影响因素进行了摸索。结果表明,超声2次,2M脲,0.5%Triton X-100,20%乙醇对目的蛋白纯化的效果最好,从而为进一步的纯化和复性奠定基础。
- 罗惠霞李敏王玉炯石晶
- 关键词：RPA(K)包涵体初步纯化
- rPA(K)原核表达产物的复性与纯化被引量：1
- 2009年
- 为探索新型rPA(K)在原核系统中表达产物的纯化和复性,采用不同的洗涤剂(脲、Triton X-100、乙醇)依次洗涤包涵体,又经硫酸铵沉淀,得到了经初纯后纯度较高的包涵体.结果表明,经2 mol/L脲1、mL/L TritonX-100、200 mL/L乙醇洗涤,15%饱和度的硫酸铵沉淀后,包涵体的纯度由16.0%提高到56.6%.在此基础上,利用稀释复性和透析复性2种方法对包涵体进行复性,以恢复产物的天然构象,获得具有生物学活性的目的蛋白.结果如下:采用透析复性法,rPA(K)的比活可达1.33×105IU/mg;采用稀释复性法,rPA(K)的比活可达1.06×105IU/mg.利用S.TagTMrEK纯化试剂盒对目的产物进行进一步纯化,并对rEK和MgCl22种洗脱剂的洗脱效果进行了比较.SDS-PAGE结果显示,MgCl2洗脱后的产物,分子量未发生变化,仍为43 ku,其纯度为72%;而rEK洗脱后的产物,其纯度达到了72%,且分子量减小至约40 ku,表明去除了融合蛋白中的非目的片段.
- 罗惠霞李敏王玉炯田楠
- 关键词：RPA(K)包涵体纯化复性
- rPA(K)的定点突变及其真核表达载体在COS-7细胞中的瞬时表达被引量：1
- 2008年
- 采用定点突变技术,对真核表达载体pCSRK上的目的片段rPA(K)进行突变,获得了含有突变体rPA(KN)(N184→Q)的真核表达载体pCSRKN.酶切和测序结果证明,成功去除了184位的糖基化位点.用LipofectamineTM2000 Reagent将pCSRKN转染至COS-7细胞,取转染后不同培养时间上清,以FAPA法进行检测.结果表明,表达产物具有良好的溶圈活性,从而验证了pCSRKN在真核系统表达的可行性.
- 李敏马爱瑛王玉炯李稷亮周栋罗惠霞
- 关键词：组织型纤溶酶原激活剂
- Reteplase(K)原核分泌表达载体的构建及其初步表达被引量：1
- 2010年
- 在原核表达载体pErA(K)的基础上,构建新型原核分泌表达载体pBrA(K),并实现其在原核表达系统中的表达。用限制性内切酶NcoI,XhoⅠ同时双酶切获得目的基因rPA(K)后,以T4连接酶将其连接到pET-20b(+)上,构建新型原核分泌表达载体pBrA(K)并实现了在大肠杆菌中表达,经纤维蛋白平板检测存在于重组菌株培养液上清中的分泌蛋白有溶纤活性。ELISA结果显示表达产物与抗t-PA抗体呈现特异性阳性反应,进一步参考标准曲线得出样品中rPA(K)的平均含量为51 ng/mL。实验结果证明新型原核分泌表达载体pBrA(K)构建成功,并实现了其在原核表达系统中的表达,为新型rPA(K)的表达优化及后续的纯化研究工作奠定了基础。
- 罗惠霞李敏王玉炯
- 关键词：RPA(K)
- 运用均匀设计法优化rPA(K)在原核系统中的表达条件被引量：3
- 2007年
- 运用均匀设计法对影响rPA(K)在大肠杆菌中表达的因素进行了优化设计,摸索出了对表达产物进行诱导表达的最佳优化表达条件。结果如下:溶解氧为90%,IPTG诱导时间为5.3h、IPTG终浓度为0.1mmol/L、培养基为HD、pH值为6.0、诱导温度为25℃。目的蛋白平均密度从0.16提高到0.48,是优化前的3倍。
- 罗惠霞李敏王玉炯马春骥
- 关键词：RPA(K)均匀设计
- 包涵体蛋白复性的几种方法被引量：35
- 2007年
- 外源基因在大肠杆菌中高水平表达时,通常会形成无活性的蛋白聚集体即包涵体。包涵体富含表达的重组蛋白,经分离、变性溶解后须再经过一个合适的复性过程实现变性蛋白的重折叠,才能够得到生物活性蛋白。
- 罗惠霞李敏王玉炯
- 关键词：包涵体复性
