国家自然科学基金(30770904)
- 作品数：3 被引量：1H指数：1
- 相关作者：陆晔玲郁婷婷王鸿利戴菁王学锋更多>>
- 相关机构：上海交通大学医学院附属瑞金医院浙江大学医学院附属第一医院上海交通大学更多>>
- 发文基金：上海市教育委员会创新基金国家自然科学基金更多>>
- 相关领域：医药卫生更多>>
- F9基因Arg327Ile新突变导致血友病B的分子发病机制研究被引量：1
- 2011年
- 目的探讨F9基因Arg327Ile(R327I)突变导致血友病B的分子发病机制研究。方法对1名血友病B患者作实验室和基因诊断,定点突变法构建F9基因R327I突变的表达质粒;瞬时转染HEK293细胞,一期法检测细胞上清液中凝血因子Ⅸ活性(FⅨ∶C),ELISA法检测细胞上清液和裂解中FⅨ抗原(FⅨ∶Ag),Western blotting检测R327I突变蛋白的分子量及表达量;免疫荧光共定位染色法检测突变蛋白在内质网和高尔基体内分布。结果瞬时表达显示该患者突变细胞标本上清液中R327I突变型FⅨ∶C为野生型的4.49%,明显降低;细胞上清液和裂解液FⅨ∶Ag分别为野生型的31%和129%,为交叉反应物质减低型(CRMR)。Western blotting显示细胞上清液中R327I突变蛋白分子量与野生型相同,但含量比野生型明显降低;免疫荧光共定位染色显示R327I突变蛋白在内质网中分布较野生型多,而在高尔基体中较野生型少。结论 F9基因R327I突变影响蛋白质合成和分泌,突变蛋白较野生型表达量偏低,同时R327I突变蛋白存在凝血功能缺陷从而导致血友病B。
- 周佳维戴菁郁婷婷陆晔玲丁秋兰王学锋王鸿利
- 关键词：血友病B基因突变发病机制
- 凝血因子Ⅸ Arg327Ile突变蛋白功能缺陷机制研究
- 2011年
- 目的研究FⅨ Arg327Ile（R327I）及Arg327Ala（R327A）突变蛋白功能，探讨R327I突变导致血友病B的分子发病机制。方法采用潮霉素筛选稳定表达细胞株，ELISA法筛选高效表达FIX重组蛋白细胞株，采用快流速Q琼脂糖凝胶和离子交换两步法分离纯化重组蛋白。ELISA和SDS—PAGE电泳分别检测重组蛋白含量和纯度。FⅦa／TF／Ca“和FⅨa／Ca^2＋活化野生型及R327I和R327A突变FⅨ蛋白，用WB法分别检测不同时间内活化生成的FⅨa。野生型及两种突变FIXa在不同FⅧa浓度下活化激活FX，以此计算野生型及两种突变FⅨa与FⅧa的解离常数；在含或不含FⅧa的条件下，检测野生型及两种突变FⅨa对不同浓度FX的激活能力，以此计算其催化效率。结果表达分离纯化野生型、R327I和R327A FⅨ重组蛋白总量分别为450、210和64μg，SDS—PAGE电泳结果显示重组蛋白纯度符合要求。两种突变蛋白均能被FⅦa／TF／Ca^2＋和FⅪa／Ca^2＋正常激活。R3271与R327A两种FIXa突变蛋白与FⅧa的结合力分别为野生型的1／4和1／5。在含FⅧa条件下，R327I和R327I突变FⅨa对FX催化效率分别为野生型的1／6和1／8。而不含FⅧa条件下，催化效率分别为野生型的1／3和1／7．4。结论R327I和R327A两种突变FⅨa与FⅧa结合异常，R327位点参与FⅧa结合，同时也与底物活化相关。R327I突变与FⅧa结合力降低导致重型血友病B的发生.
- 周佳维戴菁郁婷婷陆晔玲丁秋兰王学锋王鸿利
- 关键词：重组蛋白质类突变血友病B
- 体外表达探讨凝血因子IXArg327Ile新突变导致血友病B的分子发病机制
- 2012年
- 目的探讨凝血因子Ⅸ（FIX）Arg327Ile（R327I）突变导致血友病B的分子发病机制。方法在野生型FIX表达质粒FIX”peDNA3．1（一）的基础上，定点突变法构建FIXR327I、R327Ala（A）、R327Lys（K）和R327Asn（N）突变的表达质粒，重叠PCR构建FIX324～329（B折叠结构域）换成FVIl298～303同源结构突变表达质粒[FⅨBFVIIpeDNA3．1（一）]。将野生型及各种突变体表达质粒分别瞬时转染胚肾293T细胞，一期法检测培养上清液中FIX活性（FIX：C）及ELISA法检测细胞培养上清和细胞裂解液中FⅨ抗原（FⅨ：Ag），Westernblot法检测突变蛋白的相对分子质量及表达水平。荧光蛋白表达载体瞬时转染法检测活细胞中突变蛋白合成与分泌。结果体外瞬时转染FIXR327I突变基因的细胞FIX：C为正常野生型的4．49％，细胞上清液和细胞裂解液FIX：Ag水平分别为野生型的31．02％和129．29％，为交叉反应减低型（CRMR）。活细胞免疫荧光观察发现FIXR327I突变蛋白在细胞内含量较野生型显著增高，并且在细胞溶酶体内的含量较野生型也显著增多。FIXR327A、R327K、R327N及FIXl3FVII突变基因转染的细胞FIX：c水平较野生型减低，其中以FIXl3FVII突变降低最为明显；转染的细胞培养上清FIX：Ag水平除R327K突变型较野生型增加，其余突变型均比野生型有不同程度的降低。Westernblot法检测显示各种突变蛋白的相对分子质量与野生型相同而表达水平降低。结论FIXR327I突变基因可影响蛋白质合成和分泌，R327位点与FⅨ功能特异有关，其所在的B折叠结构域在FⅨ特异性功能中发挥重要作用。
- 周佳维王鸿利戴菁郁婷婷陆晔玲丁秋兰王学锋
- 关键词：血友病B凝血因子IX基因突变
