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优良山楂酒酿造酵母菌株的筛选与鉴定被引量：7: 2011年; 为筛选适合酿造山楂果酒的优良酿造酵母,对来自连云港花果山野生山楂样品中的酵母菌进行富集培养、稀释涂布和划线纯化,获得酵母菌株16株。通过杜氏管发酵法进行初筛,产酒精能力测试复筛,获得酵母菌株HTY06。产酒精能力测试结果表明,该酵母菌发酵10 d即可产酒精10.5%(体积分数)。并对菌株HTY06发酵力、凝聚性进行测试,结果表明该菌株发酵力较强,凝聚性强。通过形态学、生理生化及18 S rDNA序列同源性分析将菌株鉴定为酵母属(Saccharomyces)的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。; 刘姝房耀维焦豫良吕明生王淑军; 关键词：山楂果酒酵母

内生多粘类芽胞杆菌纤溶酶基因PPFE-I在大肠杆菌中融合表达及活性分析被引量：2: 2010年; 以内生多粘类芽胞杆菌EJS-3基因组DNA为模板,PCR扩增PPFE-I基因,并克隆到pMD19-T载体上,构建克隆载体pMD-PPFE-I,经测序正确后,将PPFE-I基因克隆至表达载体pET-DsbA上构建重组表达质粒pET-DsbA/PPFE-I,将其转化至E.coli BL21(DE3),在IPTG诱导下实现了融合蛋白DsbA-PPFE-I的表达,表达产物酶活性达228IU/mL。表达产物用SDS-PAGE和Western blotting进行鉴定。SDS-PAGE电泳检测表明融合蛋白主要以可溶形式表达,占菌体总蛋白的18.4%。Western blotting结果表明在相应分子量处有一条特异性条带,证实该蛋白为DsbA-PPFE-I融合蛋白。表达产物通过Ni亲和柱、凝血酶酶切及Sephadex G-100等步骤进行分离纯化,并用MALDI-TOF质谱对重组酶进行了鉴定。纯化后的表达产物在纤维蛋白平板上表现出明显的纤溶活性。; 吕凤霞陆兆新别小妹林谦张充曹林郭瑶汤彦翀; 关键词：内生菌纤溶酶

腐生葡萄球菌M36耐有机溶剂脂肪酶基因的克隆与原核表达被引量：3: 2009年; 脂肪酶是重要的工业用酶,在食品加工、生物柴油的合成等领域具有广泛的应用。但是在应用中有机溶剂对脂肪酶具有一定的毒性,因此获得耐有机溶剂的脂肪酶基因并实现高效表达是脂肪酶规模化应用的前提。本研究应用PCR技术首次从耐有机溶剂脂肪酶产生菌腐生葡萄球菌M36基因组DNA中扩增得到脂肪酶Ⅲ基因lip3(GenBank AccessionNo.FJ979867),其编码区长度为741bp,编码247个氨基酸,推测蛋白分子量大小为31.6kD。它与腐生葡萄球菌lip3推测的基因(GenBank AccessionNo.AP008934)只有83%的同源性。将该基因与大肠杆菌表达载体pET-DsbA连接,转化大肠杆菌EscherichiacoliBL21(DE3)获得重组菌株BL21(DE3)/pET-DsbA-lip3,在pH8、25oC条件下,OD600为1.0时用0.4mmol/LIPTG诱导12h酶活达到25.8U/mL。重组酶在甲醇、正己烷、异辛烷、正庚烷等有机溶剂中具有较好的耐性。lip3基因的克隆及在大肠杆菌中有效表达的研究为进一步进行基因工程改造和脂肪酶应用奠定了基础。; 汤彦翀卢亚萍吕凤霞别小妹郭瑶陆兆新; 关键词：腐生葡萄球菌基因克隆原核表达

高效产脂肪酶菌株Burkholderia cepacia C1产酶条件优化被引量：1: 2010年; 从油菜地土壤中分离到一株高效产脂肪酶菌株C1,经鉴定为Burkholderia cepacia。为了进一步提高C1脂肪酶的产量,对其产酶的发酵条件进行优化。首先采用单因子试验筛选出最佳碳源为麸皮,最佳氮源为蛋白胨。通过Plackett-Burman设计对发酵产酶的11个相关因子进行试验,筛选出3个主效因子,即蛋白胨质量浓度、橄榄油质量浓度及装液量。利用Box-Behnken试验设计和响应曲面法分析确定主效因子的最优水平,得出产脂肪酶菌株C1的最优产酶条件:1.50g/100mL麸皮、1.05g/100mL蛋白胨、1.63g/100mL橄榄油、0.2g/100mLK2HPO4、0.05g/100mLMgSO4、初始pH值为7.0、装液量为30mL。在优化条件下30℃,180r/min培养72h,脂肪酶活力达到89.65U/mL,比未优化前的28.50U/mL提高了2.15倍。; 于玉凤陆兆新汪瑾陈舟舟卢亚萍; 关键词：PLACKETT-BURMAN设计响应曲面发酵优化

高效产脂肪酶菌株C1的分离鉴定与酶学性质研究: 2010年; 采用平板筛选的方法从油菜地土壤中分离到一株高效产脂肪酶菌株C1,通过生理生化实验及16S rDNA序列分析鉴定为Burkholderia cepacia。研究其酶学性质,得出该菌脂肪酶的最适温度为65℃,最适pH为8.0,具有优良的耐温性和pH稳定性;对正己烷、乙醇耐性较好,对乙腈和乙酸耐性较差;K+、Mg2+对其酶活性有明显促进作用,Ca2+、Cu2+对其酶活性有严重抑制作用。; 于玉凤陆兆新卢亚萍刘茜茜陈舟舟; 关键词：脂肪酶酶学性质

普通变形杆菌位置非特异性脂肪酶基因的克隆及在大肠杆菌中的表达被引量：1: 2010年; 【目的】本文拟克隆普通变形杆菌(Proteus vulgaris)脂肪酶基因,并实现其在大肠杆菌中的高效表达,并检验外源表达脂肪酶的催化性质。【方法】通过PCR方法,从P.vulgaris基因组中扩增其脂肪酶基因(PVL),并将其开放读码框区域连接到表达载体pET-DsbA及pMBP-P上,在大肠杆菌中用IPTG诱导表达。我们对培养基组分及培养条件进行优化,以获得最高的酶产量。用Ni柱亲和层析法对所得重组脂肪酶进行纯化,并考察其酶学性质。【结果】PVL基因编码区含864个碱基,编码含287个氨基酸的酶蛋白。该序列在GenBank的登录号为FJ643627。PVL基因在大肠杆菌BL21内诱导表达的最佳条件为:在pH8.5的LB培养基中添加15g/L葡萄糖及200mg/L氨苄青霉素,在培养至OD600为1.2时加入100mg/LIPTG,15℃诱导15h,最高酶活达到192.2U/mL。通过亲和层析纯化了重组脂肪酶,得到一个约31kDa的蛋白条带。外源表达的脂肪酶的催化特性与野生菌脂肪酶相似,具有催化的位置非特异性,对长链脂肪酸酯亲和性最高。【结论】PVL基因在大肠杆菌中的高效表达为P.vulgaris脂肪酶的进一步研究与应用奠定基础。; 卢亚萍顾菁汤彦翀吕凤霞别小妹陆兆新; 关键词：PROTEUS 基因克隆原核表达

内生多黏类芽孢杆菌纤溶酶的纯化及其体外溶栓作用被引量：3: 2010年; 植物内生菌株EJS-3发酵液经离心除菌,硫酸铵分级沉淀,Hiprep phenylFF疏水层析,RESOURCEM Q离子交换层析和Sephacryl S-300HR凝胶过滤,获得电泳纯的多黏芽孢杆菌纤溶酶(PPFE-I),聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)测定其分子质量为63kD,高效液相色谱法(HPLC)鉴定其纯度为94.1%。每升发酵液中可获得1.6mg活性蛋白,每毫克蛋白活力达2096IU,纯度提高了14.5倍,回收率为3.3%。纯化后的纤溶酶PPFE-I具有明显的体外溶栓作用。; 吕凤霞姚正颖别小妹赵海珍王煜郭瑶陆兆新; 关键词：植物内生菌纤溶酶溶栓作用

Burkholderia cepacia S31细菌高产位置非特异性脂肪酶的发酵条件优化被引量：3: 2012年; 从油脂污染的土壤中分离获得了1株高效产脂肪酶的细菌S31,经鉴定为Burkholderia cepacia(洋葱伯克霍尔德菌)。B.cepacia S31所产脂肪酶具有活性高、耐高温、耐有机溶剂和位置非特异性水解甘油三酯等优良特性。为了进一步提高S31菌株的产酶量,对该菌产酶的发酵条件进行优化。通过单因子试验筛选出最佳碳源为麸皮,最佳氮源为蛋白胨,最佳诱导物为Tween-80。通过对培养基各组分及外部培养条件因素的正交试验,确定S31菌产脂肪酶的摇瓶发酵最优条件为:以20 g.L-1麸皮、10 g.L-1蛋白胨、40 g.L-1Tween-80、0.5 g.L-1MgSO4和2 g.L-1K2HPO4为培养基(pH 7.0),250 mL三角瓶装40 mL培养基,3%接种量,30℃、180 r.min-1培养66 h可获得最理想的酶产量,达283.6 U.mL-1,比优化前提高2.73倍。; 卢亚萍汪瑾张充吕凤霞别小妹陆兆新; 关键词：BURKHOLDERIA 脂肪酶发酵优化

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国家高技术研究发展计划(2008AA10Z309)

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