湖北省自然科学基金(2009CDA046)
- 作品数：5 被引量：27H指数：4
- 相关作者：闫云君汪小锋徐莉孙永川申旭光更多>>
- 相关机构：华中科技大学更多>>
- 发文基金：教育部“新世纪优秀人才支持计划”湖北省自然科学基金国家高技术研究发展计划更多>>
- 相关领域：生物学轻工技术与工程化学工程医药卫生更多>>
- 多拷贝毕赤酵母重组菌表达GCL摇瓶优化和高密度发酵被引量：4
- 2012年
- 目的:构建高效表达白地霉脂肪酶的毕赤酵母重组菌株,并对筛选得到的菌株进行摇瓶发酵条件优化和分批补料高密度发酵工艺研究。方法:将诱导型表达载体pPIC9K-gcl电转化至毕赤酵母GS115。通过橄榄油-罗丹明B平板和摇瓶发酵筛选高脂肪酶活力的重组菌株,运用基于TaqMan探针的实时荧光定量PCR法确定其拷贝数,并对菌株进行摇瓶发酵条件优化。在此基础上,研究重组菌在3L发酵罐中的高密度发酵工艺。结果:筛选得到一株具有3个白地霉脂肪酶基因拷贝的菌株GS115/pPIC9K-gcl 78#,初始酶活力为220 U/ml。当摇瓶发酵条件为甲醇诱导96 h,每24 h甲醇添加量1%,接种量2%,培养基初始pH 7.0,500 ml摇瓶装液量50 ml,甲醇诱导温度25℃时酶活力达735 U/ml。3L发酵罐高密度发酵176.5 h,酶活力达到3360 U/ml,总蛋白含量达到4.30 g/L,且发酵过程中细胞活性一直保持在96%以上。结论:基因拷贝数与重组菌株的产酶水平呈正相关,摇瓶优化可显著提高重组菌株的产酶能力,为白地霉脂肪酶的工业化生产奠定了技术基础。
- 智晓燕汪小锋孙永川柯锋代敏闫云君
- 关键词：巴斯德毕赤酵母高密度发酵
- 解脂耶氏酵母新型表达载体构建及癌基因rho在其中的表达被引量：1
- 2011年
- 为了简化解脂耶氏酵母表达载体构建过程、消除抗生素污染,将mel基因(编码酪氨酸酶)作为新型报告基因用于构建新型酵母表达载体,利用组装PCR人工合成基因mel,并用重叠PCR将其与同源组成型强启动子pTEF、分泌性信号肽XPR2pre及强终止区LIP2t融合,构建新型胞外及胞内表达载体,并利用其在解脂耶氏酵母野生菌株中表达人源癌基因rho。成功获得mel全基因并将其与启动子、信号肽和终止区融合,得到融合片段TXML,用其替换原有表达载体的筛选标记基因ura3d4,构建得到新型胞外及胞内表达载体pINA1297-M和pINA1297-a-M,转化后的酵母阳性转化子性状明显,随后利用此新型表达系统获得可溶性异源蛋白Rho。首次实现了将mel作为一种便捷、价廉、无污染的新型筛选标记基因运用于非常规酵母表达系统中,更为mel在其它真核表达系统中的运用奠定了技术基础;获得的可溶性Rho蛋白可为研究其性质、结构、功能及与Rho癌基因家族其它成员的相互作用提供条件。
- 赵鹤云汪小锋潘小幸刘云徐莉闫云君
- 关键词：解脂耶氏酵母抗生素污染
- 洋葱伯克霍尔德菌脂肪酶的基因改造及其在毕赤酵母中组成型和诱导型的表达被引量：10
- 2010年
- 【目的】克隆洋葱伯克霍尔德菌（Burkholderia cepacia）脂肪酶基因,实现其在毕赤酵母中快速、安全和稳定性的大量表达。【方法】首先设计引物扩增B.cepacia脂肪酶基因,然后应用生物信息学方法分析B.cepacia和毕赤酵母整体密码子使用情况、脂肪酶基因信号肽及密码子偏好性。在此基础上,运用overlap PCR对脂肪酶基因中低使用频率密码子进行改造并同时降低基因的G＋C含量,获得优化的脂肪酶基因。再分别把原始和优化的脂肪酶基因导入载体pGAPZα和pPIC9K中,获得组成型表达载体pGAPlipW、pGAPlipO和诱导型表达载体pPIClipW、pPIClipO。分别将所得4种载体转入GS115中,得到一系列工程菌。经发酵和NTA树脂纯化后,对脂肪酶的酶学性质进行了初步研究。【结果】4种工程菌的脂肪酶活力分别为pPIClipW37.8U/mL,pPIClipO129.5U/mL,pGAPlipW40.2U/mL和pGAPlipO184.3U/mL。改造后脂肪酶活力比原始脂肪酶提高了4.6倍。酶学性质研究表明,脂肪酶在60℃时活力最高,在40℃-65℃范围内非常稳定;脂肪酶最适pH值为9.0,在pH6.0-pH10.0范围均表现很好的稳定性。【结论】通过overlap PCR改造后的脂肪酶显著提高了其在毕赤酵母中的表达效率,且GAP启动子比AOX1启动子更适合于B.cepacia脂肪酶的表达。大量表达的重组脂肪酶的性质与野生脂肪酶的性质相同,符合生产要求。
- 贾彬刘文山杨江科叶才伟徐莉闫云君
- 关键词：洋葱伯克霍尔德菌OVERLAPGAP启动子
- 毕赤酵母中表达透明颤菌血红蛋白提高重组脂肪酶的表达被引量：7
- 2011年
- 解脂耶氏酵母胞外脂肪酶Lip2(YlLip2)是一种具有广泛应用前景的工业酶。为了改善高密度发酵生产YlLip2过程中的溶氧限制,提高YlLip2的表达量,将YlLip2基因lip2和透明颤菌血红蛋白(VHb)基因vgb分别置于AOX1启动子和PsADH2启动子的调控之下,进行YlLip2和VHb在毕赤酵母中的共表达。PsADH2启动子来源于树干毕赤酵母Pichia stipitis,在低氧条件下能被激活。SDS-PAGE和CO-差式光谱分析表明,YlLip2和VHb在重组菌中成功实现了共表达。在氧限制性条件下,VHb表达的细胞(VHb+,GS115/9Klip2-pZPVT)与对照细胞(VHb?,GS115/9Klip2)相比,摇瓶和10 L发酵罐中YlLip2表达量分别提高了25%和83%。此外,在低氧条件下,VHb+细胞在10 L发酵罐中的生物量也比VHb?细胞高。文中也获得了一株表达了VHb的并携带有多个lip2基因拷贝的克隆子GS115/9Klip2-pZPVTlip2 49#,在低氧条件下,该克隆子在10 L发酵罐中的最高脂肪酶水解活力达33 900 U/mL。因此,在毕赤酵母中用PsADH2启动子表达VHb,同时增加lip2基因的拷贝数是提高YlLip2表达量的一种有效策略。
- 汪小锋孙永川申旭光柯锋徐莉刘云闫云君
- 关键词：脂肪酶透明颤菌血红蛋白解脂耶氏酵母毕赤酵母
- 带His-tag的解脂耶氏酵母脂肪酶Lip2在毕赤酵母中的表达及纯化被引量：5
- 2011年
- 将去自身信号肽并且N-端带6×His标签的YlLip2基因克隆至表达载体pPIC9K中,电转化GS115获得高效表达脂肪酶His6-YlLip2的基因工程菌。筛选到的阳性克隆子摇瓶发酵脂肪酶活力最高为400U/ml。对重组毕赤酵母在10 L发酵罐中表达His6-YlLip2的分批补料发酵工艺进行了初步优化,探讨了培养基、pH、温度对生物量和重组蛋白表达量的影响。结果表明:采用FM22培养基,诱导温度为25℃,pH 5.0,甲醇诱导114 h后His6-YlLip2的最高酶活力达到3160U/ml。SDS-PAGE分析表明,蛋白的分子量大约为38kDa。重组的His6-YlLip2经镍柱一步纯化后的纯度达到95.43%,比酶活达到4250U/mg。
- 汪小锋申旭光赵鹤云孙永川纪昌涛闫云君
- 关键词：毕赤酵母解脂耶氏酵母组氨酸标签高密度发酵脂肪酶
