国家自然科学基金(30471290)
- 作品数：15 被引量：56H指数：5
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- 相关机构：西北农林科技大学河南农业大学安徽农业大学更多>>
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- 表达猪瘟病毒石门株E2抗原的重组腺病毒构建及免疫性研究被引量：5
- 2007年
- 应用PCR从pMD18-T-E2质粒中扩增编码猪瘟病毒(CSFV)E2蛋白的基因片段,定向克隆到重组腺病毒Adeasy-1系统的穿梭质粒pAdTrack-CMV上,采用细菌内同源重组"两步转化法"构建携带CSFVE2基因的重组腺病毒基因组质粒pAdEasy-E2,转染293细胞,成功包装出重组腺病毒pAd-E2,PCR证实E2基因已整合至腺病毒基因组中,Western blot结果检测到重组病毒转染293细胞中E2蛋白的表达。ELISA检测结果表明,pAd-E2能刺激小鼠产生高效价的抗体,也能刺激猪体产生抗体。将pAd-E2通过肌肉和皮下接种途径免疫商品化猪2次,21d后用1000倍TCID50CSFV强毒攻击。pAd-E2免疫组有1/4头死亡,而非重组腺病毒pAd-CMV免疫组和空白对照组全部死亡。该研究为研制猪瘟基因工程疫苗提供了有用的数据。
- 孙永科杨玉艾王养会张彦明
- 关键词：腺病毒猪瘟病毒E2基因同源重组
- 哺乳动物肠上皮细胞的原代培养被引量：11
- 2007年
- 肠上皮细胞是由多功能干细胞分化成的一个高度组织化系统。从离体的肠组织中分离的肠隐窝单位或肠上皮细胞可在数小时内保持高度活力,但要长期(达到10 d)原代培养肠上皮细胞仍然很困难。文章对肠上皮细胞的分离、鉴定、原代培养所需维持培养基和生长培养基的设计及培养条件等方面进行了综述。
- 刘芳宁张彦明
- 关键词：原代培养哺乳动物小肠结肠上皮组织
- 表达猪瘟病毒石门株E0和/或E2基因重组非复制型腺病毒疫苗的免疫保护试验被引量：3
- 2007年
- 用已构建好的表达猪瘟病毒石门株E0基因的重组腺病毒pAd-E0、表达猪瘟病毒石门株E2基因的重组腺病毒pAd-E2以及联合表达猪瘟病毒石门株E0-E2基因的重组腺病毒pAd-E0-E2,肌肉和皮下接种免疫商品猪2次(间隔20 d),同时设非重组腺病毒PAD-CMV、常规猪瘟疫苗和空白对照组。二免21 d后进行CSFV石门株强毒超致死量(1 000倍TCID50)攻击,研究表达猪瘟保护性抗原基因重组腺病毒疫苗的免疫效果。结果表明,pAd-E0、pAd-E2和pAd-E0-E2免疫组猪的死亡率分别为50%,25%和25%,而常规猪瘟兔化弱毒疫苗免疫组的死亡率为40%,pAd-CMV免疫组和空白对照组猪全部死亡;在攻毒前,重组腺病毒免疫组抗体水平普遍较低,商品化疫苗免疫组能100%检测到抗体,而非重组腺病毒和空白对照没有检测到抗体;攻毒后pAd-E0、pAd-E2和pAd-E0-E2试验组中分别有75%,50%和50%猪体温超过40℃,常规苗试验组80%体温超过40℃,而PAD-CMV组和空白对照组所有试验猪体温均超过40℃,表明重组腺病毒疫苗具有一定的保护效果。表明,仅含有E0基因的重组腺病毒pAd-E0的免疫保护效果和常规疫苗还有距离;含有E2基因和E0-E2基因的重组腺病毒的免疫保护效果不亚于常规疫苗。
- 孙永科杨玉艾王养会李普华张彦明
- 关键词：猪瘟病毒重组腺病毒E0基因E2基因
- 鸡胚成纤维细胞与鸡气管黏膜上皮细胞共培养体系的建立被引量：2
- 2010年
- 【目的】建立鸡气管黏膜上皮细胞(Chicken trachea epithelium cells,CTECs)和鸡胚成纤维细胞(Chicken embryo fibroblasts,CEFs)共培养体系,为CTECs体外培养研究与应用奠定基础。【方法】利用细胞套皿培养方法,使CEFs与CTECs体外共培养在一个营养体系中,用含有不同促细胞生长因子(氢化可的松(HC)、转铁蛋白(TF)、人表皮生长因子(HEGF)或牛垂体提取物(BPE))和血清(胎牛血清、鸡血清)的培养液培养,观察各组CTECs的生长情况,绘制生长曲线,记录CTECs体外生长增殖的特点。【结果】与单独培养的CTECs相比,共培养体系中的CTECs体外贴壁、生长增殖能力均显著提高,72h能够铺满整个培养皿,并呈典型的上皮细胞"铺路石"状排列。共培养体系中的CTECs,在缺少3种重要哺乳动物气管黏膜上皮细胞培养所需的促细胞生长因子培养液中,仍能保持较好的生长能力,大大降低了CTECs的培养成本。【结论】成功建立了CTECs与CEFs的共培养体系,为CTECs的体外培养和应用提供了技术支持。
- 孙裴张彦明杨小云唐青海魏建忠李郁王桂军
- 关键词：共培养体系
- 鸡气管上皮细胞分离培养及传支病毒在其培养特性研究被引量：10
- 2008年
- 【目的】探索鸡气管上皮细胞(chicken trachea epithelium,CTE)分离培养技术,并研究传染性支气管炎病毒(infectious bronchitis virus,IBV)在CTE中培养特性。【方法】利用气管灌注冷消化法分离培养CTE,对CTE特异性8/18角蛋白作免疫组化鉴定上皮细胞。培养的CTE分别接种IBVM41株和T株,分别在接种后第12～96小时观察接毒细胞形态学变化,应用电镜技术观察CTE细胞病变和病毒粒子结构,利用RT-PCR技术检测CTE中病毒核酸并对CTE中IBV的血凝性和鸡胚致病性进行检测。【结果】利用灌注冷消化法可以获得形态完整并带有纤毛的CTE,细胞活性高,经过3步纯化后的CTE均一性高、生长快。两株IBV感染的CTE分别在接毒72和84h后产生明显的细胞病变效应(cytopathic effect,CPE),血凝性和致鸡胚病变检测结果呈阳性。【结论】本研究成功分离培养了CTE,可以为CTE相关研究提供技术支持,并为IBV基础研究和应用奠定基础。
- 孙裴张彦明张浩高春生张为民王晶钰郭抗抗党如意
- 关键词：IBV
- 猪瘟病毒E2基因的哺乳动物细胞表达被引量：2
- 2005年
- 利用PCR技术扩增出猪瘟病毒主要结构蛋白E2基因的全序列,将其克隆到真核表达载体PEGPF-C1中,获得重组质粒PEGPF-E2,经PCR,酶切鉴定和序列分析证明目的基因的大小、插入位置和读码框完全正确。利用脂质体将阳性质粒PEGFP-E2转染入猪肾来源的细胞PK-15中,G418筛选出阳性的细胞克隆,通过PCR证明E2基因存在于筛选出的阳性细胞克隆中。利用荧光倒置显微观察阳性细胞发现有融合蛋白的表达,利用夹心ELISA猪瘟病毒抗原检测试剂盒检测证明表达的融合蛋白为猪瘟病毒E2基因编码蛋白。
- 张永国张彦明孙裴郭抗抗魏中锋王晶钰倪斌
- 关键词：阳性E2基因夹心ELISA哺乳动物细胞猪瘟病毒
- TGF-β1诱导SUVEC向平滑肌样细胞转分化的初步研究
- 2007年
- 用不同浓度TGF-1β对猪脐静脉血管内皮细胞(SUVEC)进行诱导,研究体外诱导SUVEC向平滑肌细胞分化的可能性。倒置显微镜下观察诱导前后细胞形态的变化,并采用免疫细胞化学SP法对细胞表面特异性标志物进行染色。结果表明,诱导后细胞失去内皮细胞典型的铺路石样形态,而呈现出肌成纤维样细胞;对诱导后的细胞进行免疫组化检测,发现5～10ng.mL-1 TGF-1β诱导后,平滑肌特异性蛋白-αSMA的相对表达量均显著升高;而浓度升高为20 ng.mL-1时,升高不显著;内皮细胞特异性标志(F-ⅧRAg)的表达均显著下降。该研究表明TGF-1β可诱导猪脐静脉血管内皮细胞向肌样细胞分化,但诱导分化的能力与TGF-1β的浓度有关。
- 王文秀张彦明熊奎州张浩邓文代晨
- 关键词：脐静脉血管内皮细胞转化生长因子Β1转分化平滑肌样细胞
- 猪脐静脉血管内皮细胞永生化的初步研究被引量：5
- 2007年
- 为了建立稳定的血管内皮细胞系,进而为研究猪瘟病毒致病机理提供理想的细胞模型,将脂质体转染的pCIneo-hTERT质粒导入原代猪脐静脉血管内皮细胞中,经G418抗性筛选,挑取阳性克隆并扩大培养。对转染后的细胞进行形态观察,研究其增殖及生长特征,并对其端粒酶活性进行了鉴定。结果表明,转染细胞单层贴壁生长,有接触抑制性,呈铺路石状;F-ⅧAg和CD34免疫荧光鉴定阳性,具有转染前细胞特征;转染后细胞培养代数增加,传至第10代和15代转染后细胞端粒酶活性检测为阳性。说明hTERT转染可以延长猪血管内皮细胞的寿命。
- 马泉荔洪海霞张彦明徐浩杨蒙苏正元
- 关键词：端粒酶催化亚基脐静脉血管内皮细胞
- 猪支气管黏膜上皮细胞的分离培养和传代研究被引量：10
- 2008年
- 利用气管-支气管扎结灌注酶冷消化法分离气管黏膜上皮细胞,比较胰蛋白酶和链霉蛋白酶消化效果,并研究含不同细胞生长因子和血清浓度的培养体系来寻找经济、易重复的气管上皮细胞最适培养技术。用抗8/18细胞角蛋白免疫组化法鉴定气管上皮细胞,用流式细胞仪检测细胞凋亡来分析本研究中气管上皮细胞最大传代次数。研究结果表明胰蛋白酶消化气管所得的目的细胞量小、活性差、细胞贴壁和生长困难,链霉蛋白酶灌注冷消化法可获得数量大、活性高、纯度好的目的细胞;基础的上皮细胞培养体系中含低浓度血清、转铁蛋白和人表皮生长因子可以有效保证气管上皮原代和传代生长。本研究所分离的气管上皮细胞可连续传到第6代,传代细胞活性好、纯度高,可为进一步的气管上皮细胞永生化研究提供材料和奠定技术基础。
- 孙裴张彦明杨小云温元鹏张浩何建锋郭抗抗党如意
- 关键词：气管-支气管上皮细胞传代
- 猪瘟病毒石门株E2基因在永生化猪血管内皮细胞的表达被引量：1
- 2008年
- 利用DNA重组技术将猪瘟病毒石门株囊膜蛋白E2基因定向插入逆转录病毒载体pBABE-puro中,构建重组逆转录病毒载体pBABE-puro-E2。将pBABE-puro-E2和辅助质粒pVSV-G经磷酸钙共沉淀法转染293GP包装细胞系,将其包装为完整的逆转录病毒假病毒;用包装好的假病毒在polybrene的介导下转导第30代的永生化猪脐静脉血管内皮细胞(SUVEC),用嘌呤霉素筛选阳性细胞,并将筛选出的阳性细胞腹腔免疫BALB/c小鼠。RT-PCR检测SUVEC内的E2基因,用间接免疫荧光试验鉴定E2蛋白在SUVEC上的表达,间接ELISA试验检测小鼠血清抗体。结果表明,CSFVE2基因导入猪脐静脉血管内皮细胞获得表达,而且成功诱导小鼠产生抗E2蛋白的抗体。
- 解林红郭抗抗张彦明徐钰徐彦召王文秀
- 关键词：猪瘟病毒E2基因
