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国家自然科学基金(30671067): 作品数：21 被引量：50H指数：4; 相关作者：窦忠英杨春荣陈冬梅吕长荣辛晓玲更多>>; 相关机构：西北农林科技大学河南省农业科学院河南工业大学更多>>; 发文基金：国家自然科学基金国家高技术研究发展计划重庆市自然科学基金更多>>; 相关领域：农业科学生物学医药卫生更多>>

胎猪胰腺干细胞扩增及诱导: 2009年; 目的寻找胰腺干细胞扩增方法，为研究糖尿病的细胞治疗提供种子细胞。方法无菌采集胎猪胰腺，经胰酶消化，以含10％血清的RPM11640培养基培养。细胞长满皿底85％时，用胰酶消化传代，传代5～6次后细胞活力下降，细胞大量死亡漂浮，留下少数贴壁的小圆细胞。将培养基中的血清浓度提高到15％，贴壁的小圆细胞能快速增殖并形成细胞克隆，4～6d便可融汇成单层。采用免疫组织化学方法对所获得的的细胞进行胰腺干细胞特征检测。结果经上述方法处理的细胞具有旺盛的增殖能力，可以连续传代，目前已传至64代。采用免疫组织化学检测细胞表达胰腺干细胞特征性标志物，胰肠同源域因子1（PDX-1）、葡萄糖转运子2（GLUT-2）、巢蛋白、波形蛋白；经诱导后细胞表达胰腺内分泌细胞的标志为胰高血糖素、胰岛素、生长抑素、胰多肽。结论通过该方法可以获得大规模扩增的胰腺干细胞，该细胞在体外诱导可分化形成胰腺内分泌部4种主要细胞。; 王赟楚元奎杨春荣王华岩窦忠英; 关键词：胰岛胰腺干细胞糖尿病免疫组织化学胎猪

牛诱导性多能干细胞向心肌细胞的诱导分化被引量：2: 2010年; 【目的】研究牛诱导性多能干细胞(Bovine induced pluripotent stem cells,biPSCs)向心肌细胞的分化能力。【方法】将biPSCs悬浮培养制备类胚体,采用类胚体介导体外自由分化与定向诱导分化(添加RA、DMSO和RA+DMSO3种诱导物)的方法,使biPSCs在体外分化,比较了biPSCs在3种不同心肌诱导条件下定向分化为心肌细胞的诱导效率;分别提取biPSCs、类胚体及不同诱导体系分化细胞的总RNA,用RT-PCR检测心肌细胞发育标志基因的表达。【结果】biPSCs在悬浮条件下培养7d,能够形成典型球形和囊腔样类胚体。类胚体再贴壁培养7d,经过免疫细胞化学检测,贴壁细胞大量分化为α-actin阳性的心肌样细胞。在体外诱导分化体系中,RA+DMSO共同诱导的效率较RA和DMSO单独诱导显著增高(P<0.05)。RT-PCR结果显示,各组分化后的细胞中心肌细胞发育特异性基因ACTA2与GATA4均有高水平表达。【结论】biPSCs在体外悬浮培养能够形成类胚体,类胚体贴壁培养后可以分化为α-actin阳性的心肌样细胞;分化形成的心肌样细胞均表达心肌特异性基因。; 陈冬梅吕长荣辛晓玲窦忠英; 关键词：诱导性多能干细胞细胞分化心肌细胞

牛Klf4基因重组反转录病毒载体的构建及产毒细胞株的建立被引量：1: 2010年; 为了克隆牛Klf4基因并构建重组反转录病毒载体,得到稳定的产毒细胞株,本研究设计了带有酶切位点的一对引物,以接触抑制生长状态的MDBK细胞为材料,用RT-PCR方法克隆出牛Klf4基因的开放阅读框序列,将之插入干细胞反转录病毒载体pMSCVneo构成真核表达载体pMSCV-Klf4;采用脂质体法将pMSCV-Klf4转染包装细胞PT67,通过G418筛选得到稳定的产毒细胞株,电镜观察培养液上清中的病毒颗粒,同时病毒感染NIH3T3细胞测定其病毒滴度。结果表明,本研究克隆的牛Klf4基因开放阅读框序列与已发表序列(NM-001105385)比对有99.9%的高同源性;构建的重组载体质粒可正常包装,电镜下可观察到典型的病毒颗粒,筛选出的产毒细胞株病毒滴度达7.16×107CFU·mL-1。本研究成功构建的真核表达载体pMSCV-Klf4和得到的产毒细胞株,为进一步开展有关牛iPS细胞的研究奠定了基础。; 辛晓玲吕长荣陈冬梅窦忠英; 关键词：IPS细胞反转录病毒载体

固本养肺活血方对老年慢阻肺稳定期患者的临床疗效被引量：15: 2014年; 目的探讨固本养肺活血方对老年慢阻肺(COPD)稳定期患者的治疗效果。方法选取该院2011年11月至2013年11月诊治的老年COPD稳定期患者114例,根据治疗方案分为两组,常规治疗患者57例为对照组,常规治疗加用固本养肺活血方治疗患者57例为观察组,比较两组患者治疗前后相关指标的改变情况和综合临床疗效。结果治疗后,两组患者临床症状评分、肺动脉压均显著降低,6 min步行距离显著增加。观察组患者临床症状评分、肺动脉压均明显低于对照组,观察组患者6 min步行距离明显大于对照组,观察组患者总有效率明显高于对照组(均P<0.05)。结论固本养肺活血方可明显改善老年COPD稳定期患者的临床病症和心肺功能,治疗效果显著,值得临床推广使用。; 徐萍利江程澄; 关键词：慢阻肺稳定期

猪胰腺干细胞分离与培养被引量：2: 2008年; 【目的】探寻一种简单的胰腺干细胞的分离方法,以便为糖尿病的细胞治疗研究提供丰富的种子细胞。【方法】采用胰酶消化法分离获得细胞,利用仅含有5%的血清的RPMI1640培养基培养细胞,低浓度的血清使得细胞大量死亡漂浮,只留下少数贴壁的小圆细胞。而后将血清浓度提高到15%以上继续培养;采用免疫组化方法对获得的细胞是否具有胰腺干细胞特征予以检测,并测定了细胞的生长曲线。【结果】在血清浓度提高后每个小圆细胞能快速增殖并形成一个克隆,经过这样增殖后的细胞可以连续传代,目前已传至60代。经免疫组化检测,细胞表达PDX-1、GLUT-2、vimentin等胰腺干细胞的标志;细胞也表达Glucagon、insulin、somatostatin、polypeptide等胰腺内分泌细胞的标志.【结论】通过本方法获得的细胞经检测确定为胰腺干细胞,在体外可自发分化形成胰胰内分泌部4种主要细胞。; 王赟窦忠英乔海赵婷杨春荣; 关键词：胎猪胰岛胰腺干细胞糖尿病

仔猪胰腺干/祖细胞的生物学特性被引量：1: 2012年; 分离1日龄长白仔猪的胰腺细胞后,通过显微镜和电镜观察细胞生长形态和超微结构,运用细胞计数法制作细胞生长曲线测定其群体倍增时间,采用免疫组化法测定细胞生长不同时期的表面标志蛋白的表达,用肝细胞因子和尼克酰胺联合诱导其向功能性β细胞分化,并测定了分化细胞对葡萄糖的反应能力。结果显示获得的仔猪胰腺祖/干细胞具有多种形态,以神经样细胞克隆生长占优势,电镜超微结构证实其具有核质比高、细胞器不分化的干细胞态特征。试验测得第1代和第3代群体的倍增时间分别为96.0、307.7h,仔猪胰腺祖/干细胞表达胚胎干细胞标志Oct4、SSEA-1、SSEA-4,也表达胰腺干细胞的标志PDX-1、CK7等。仔猪胰腺干/祖细胞的向β细胞诱导分化细胞对22mmol/L葡萄糖的刺激产生强烈的胰岛素分泌反应,胰岛素分泌量可达321.75mIU/L。结果证实仔猪胰腺干/祖细胞具有干细胞和胰腺祖的表面标志和超微结构,同时具有分化成分泌胰岛素β细胞的能力。; 张慧茹赵红月冯若鹏楚元奎窦忠英; 关键词：胰腺干细胞仔猪生物学特性胰岛素

猪胰岛素启动子报告系统的构建及其在胰岛间充质干细胞诱导分化检测中的应用被引量：4: 2015年; 为了构建猪胰岛素启动子(IP)-绿色荧光蛋白(GFP)报告系统,评价其在胰岛间充质干细胞(PIMSCs)诱导分化过程中的应用价值,试验以胎猪胰腺组织基因组DNA为模板,PCR扩增获得IP基因片段,T载体连接测序后,构建p EGFP-IP重组质粒,经PCR和双酶切鉴定后,分别转染原代胎猪胰腺细胞和PIMSCs,48 h后观察荧光表达情况,转染重组质粒的PIMSCs体外诱导2周后,观察绿色荧光表达情况,并进行GFP和胰岛素的Western-blot检测。结果表明:PCR扩增得到1条659 bp大小的基因片段,其测序结果与Gen Bank公布的IP基因序列一致。经PCR和双酶切鉴定,p EGFPIP重组质粒构建成功。重组质粒转染48 h后,部分原代胎猪胰腺细胞强表达绿色荧光,而PIMSCs则不表达。诱导2周后,部分PIMSCs表达绿色荧光,同时随着绿色荧光的表达增强,其胰岛素表达也相应增强。说明成功构建出了猪胰岛素启动子-绿色荧光蛋白报告系统,该报告系统具有表达特异性,可用于检测由PIMSCs诱导分化得到的胰岛素分泌细胞。; 楚元奎杨丽曹晖华进联窦忠英; 关键词：诱导分化

山羊胚胎干细胞的分离与培养: 2008年; 对关中奶山羊配种后6～7天的桑椹胚和囊胚，分别采用全胚培养法、酶消化法和免疫外科法进行处理。将处理后的胚胎培养于小鼠胎儿成纤维细胞（MEF）饲养层上，分离培养山羊胚胎干细胞（Embryonic stem cell，ESC）。对分离传代的山羊ESCs分别进行免疫组化染色，RT-PCR检测和体外诱导分化试验。结果表明，全胚培养法易于胚胎贴壁形成原代集落，采用全胚培养法获得的ESCs有一株目前已传至18代。山羊ESCs Nanong、Oct4、SSEA-3免疫组化染色呈阳性，SSEA-1免疫组化染色呈弱阳性，SSEA-4免疫组化染色呈阴性，RT-PCR检测显示其表达Nanog、Oct4、端粒酶、CD117。山羊ESCs经DMSO体外诱导可以向心肌细胞分化，这些试验均表明该细胞具有ESCs的生物学特性。; 闫龙雷蕾杨春荣高志敏雷安民马晓玲窦忠英; 关键词：山羊胚胎干细胞内细胞团

牛sox2基因的克隆及重组反转录病毒载体的构建被引量：1: 2009年; 为了构建包含牛sox2基因编码序列的重组反转录病毒载体,获得有感染性的病毒颗粒,本研究以胎牛原始生殖嵴为材料,用RT-PCR方法克隆出牛sox2基因的开放阅读框序列,将其亚克隆至pMD18-T载体并测序。结果表明获得的基因片段与发表的牛sox2基因序列(Gen Bank Accession No.NM-001105463)高度同源;将测序正确的重组T载体用EcoRI和BglII酶切,基因片段插入反转录病毒载体pMSCVneo的相同酶切位点,成功构建了重组反转录病毒载体pMSCV-sox2。采用脂质体法用pMSCV-sox2转染包装细胞PT67,同时用pMIG(含绿色荧光蛋白)作为阳性对照,经流式细胞仪测定,该载体转染效率达到68.3%;转染后PT67细胞经G418筛选得到稳定的产毒细胞株,其病毒滴度达8.16×107CFU/mL,为下一步特定因子诱导牛体细胞转变为牛iPS细胞的研究奠定了基础。; 辛晓玲吕长荣陈冬梅窦忠英; 关键词：IPS细胞反转录病毒载体

人神经元素3基因重组逆转录病毒表达载体的构建及其包装细胞株的建立被引量：2: 2010年; 为构建表达人神经元素3基因(neurogenin 3,ngn3)的重组逆转录病毒载体,建立稳定表达ngn3的包装细胞株,本研究以流产人胎儿胰腺组织为材料,通过RT-PCR方法克隆出人ngn3基因,将其连接到pMD18-T载体上并测序,结果表明,测序得到的基因序列与发表的人ngn3基因序列(GenBank Accession No.BC126468)完全一致。将EcoRI和HpaI双酶切后的基因片段构建到pMSCV-neo逆转录病毒载体中,酶切鉴定结果表明,pMSCV-ngn3重组逆转录病毒载体构建成功。脂质体法将pMSCV-ngn3重组载体导入PT67包装细胞,G418筛选后,对得到的细胞株进行RT-PCR和免疫组化检测,结果显示,该细胞株在mRNA水平和蛋白水平均稳定表达Ngn3;收集该细胞株的培养上清液,进行RT-PCR检测及电镜观察,结果表明,该细胞株将导入的重组逆转录病毒载体pMSCV-ngn3包装成了具有感染性的病毒颗粒,并将其释放到了培养上清液中。以上结果表明PT67-ngn3包装细胞株建立成功。该细胞株的成功建立,为下一步将ngn3基因应用于提高人胎儿胰腺祖细胞诱导分化效率方面的研究奠定了基础。; 楚元奎吕长荣陈冬梅曹晖窦忠英; 关键词：逆转录病毒载体

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