甘肃省科技计划项目(1104NKCA167)
- 作品数：6 被引量：12H指数：2
- 相关作者：黄银君牟克斌刘学荣刘斌许涛更多>>
- 相关机构：中国农业科学院兰州兽医研究所甘肃农业大学甘肃畜牧工程职业技术学院更多>>
- 发文基金：甘肃省科技计划项目更多>>
- 相关领域：农业科学生物学更多>>
- 小反刍兽疫N5蛋白的原核表达及间接ELISA检测方法的建立被引量：4
- 2017年
- 【目的】建立一种适用于PPRVN蛋白抗体的间接ELISA检测方法,应用于PPR防疫.【方法】根据GenBank中登录小反刍兽疫病毒(PPRV)Nigeria 75/1株N基因序列进行人工合成,设计1对特异引物对N5基因扩增,经测序分析后将N5基因片段和原核表达载体pET-32a(+)相连接,成功构建pET-32a-N5质粒.将pET-32a-N5转化于TransB(DE3)原核表达感受态细胞后用IPTG诱导表达获得重组蛋白,经SDS-PAGE分析和Western-blot鉴定,重组蛋白分析具有良好的反应原性.【结果】利用原核表达纯化的PPRV N重组蛋白作为包被抗原,初步建立了一种能够检测针对PPRV N蛋白抗体的间接ELISA方法.用建立的方法对112山羊份血清进行了抗体检测,该方法与竞争ELISA试剂盒对比,临床符合率94.8%.【结论】该方法具有较好的敏感性、重复性和特异性.
- 刘斌陈晓宇牟筱黄银君牟克斌祁光宇许涛胡永浩
- 关键词：小反刍兽疫间接酶联免疫吸附试验
- 稳定表达T_7RNA聚合酶的猪睾丸细胞系的建立被引量：1
- 2012年
- 根据GenBank中登录的T7RNA聚合酶基因参考序列,设计合成了1对特异性引物扩增对T7RNA聚合酶基因进行扩增,将测序正确的T7RNA聚合酶基因和真核表达载体pIRES2-EGFP双酶切后进行连接构建pIRES2-EGFP-T7RNA RNA质粒。再将构建正确的pIRES2-EGFP-T7RNA质粒经用脂质体法转染猪睾丸细胞,通过G418筛选和单细胞克隆化,同时构建pET-32a-RED原核表达质粒载体,用其检测T7启动子控制下的红色荧光蛋白的表达。结果表明,建立的ST/T7RNA细胞系经20次传代仍然能稳定表达T7RNA聚合酶。结果显示,成功建立能稳定表达T7RNA聚合酶的猪睾丸细胞系,为猪瘟病毒反向遗传操作平台奠定了基础。
- 祁光宇刘萍刘斌王凡武发菊杜平董金杰黄银君牟克斌刘学荣
- 山羊痘病毒P32基因的克隆及毕赤酵母中的表达
- 2015年
- 将人工优化合成的山羊痘病毒P32基因和表达载体p PIC9K同时双酶切后相连,构建p PIC9K-IL-2重组表达载体。将线性化的载体p PIC9K-P32电转化毕赤酵母GS115,对重组酵母转化子经MD平板筛选和PCR分析鉴定后,经G418抗性梯度筛选,获得多拷贝重组菌株,甲醇诱导表达后进行SDS-PAGE和Western blot。SDS-PAGE电泳显示出相对分子质量约为30 k Da目的蛋白表达条带,Western blot分析表明表达的蛋白具有反应原性。本研究成功构建载体p PIC9K-P32,并且P32基因已整合到酵母基因组中,为亚单位疫苗和鉴别诊断试剂奠定了基础。
- 田启会祁光宇杨织瑞
- 关键词：羊痘病毒P32基因毕赤酵母分泌型表达载体BLOT
- pPIC9K-IL-2重组质粒的构建及其在毕赤酵母中的表达被引量：1
- 2014年
- 根据Ovis aries interleukin(IL-2)序列设计1对引物,用PCR法扩增的目的基因进行克隆,将测序正确的IL-2基因片段和表达载体pPIC9K同时双酶切后相连,构建pPIC9K-IL-2重组表达载体.将线性化的载体pPIC9K-IL-2电转化毕赤酵母GS115,对重组酵母转化子经MD平板筛选和PCR分析鉴定后,用G418(4g/L)筛选到多拷贝菌株,进行不同条件下甲醇诱导表达.结果表明:经PCR鉴定IL-2基因已整合到酵母基因组中,表达产物经SDS-PAGE电泳分析发现相对分子质量约为18ku目的蛋白表达条带,本研究成功构建了高效表达重组羊IL-2毕赤酵母菌株,为新型细胞因子佐剂的研发奠定了基础.
- 刘斌祁光宇陈晓宇王宇牟克斌黄银君刘学荣
- 关键词：毕氏酵母SDS-PAGE
- 猪流行性腹泻病毒HB2015分离株N基因表达及单克隆抗体的制备被引量：4
- 2018年
- 根据已经发表的猪流行性腹泻病毒N基因序列(GenBank:KX016034.1),设计1对特异性引物(上、下游分别插入Bam HⅠ和XhoⅠ酶切位点),通过RT-PCR技术扩增N基因,在测序鉴定正确后经Bam HⅠ和XhoⅠ双酶切,将其克隆至原核表达载体pET-32a上,获得重组表达质粒pET32a-N。表达的蛋白质经纯化后进行Western blotting鉴定分析。以表达的PEDV-N蛋白作为抗原,免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合,经间接ELISA筛选及亚克隆,获2株PEDV-N特异性单克隆抗体。对获得的单抗进行Western blotting鉴定和间接免疫荧光试验(IFA)分析,结果显示2株单抗均能与PEDV-N蛋白特异性结合和识别。以上结果表明PEDV-N蛋白在大肠杆菌中成功表达,且成功制备了2株具有生物学活性的特异单抗,为建立PEDV金标试纸诊断方法奠定了基础。
- 祁光宇刘斌刘斌
- 关键词：猪流行性腹泻病毒N基因原核表达单克隆抗体
- 小反刍兽疫病毒N基因部分片段克隆表达及鉴定被引量：2
- 2013年
- 根据GenBank中登录小反刍兽疫病毒(PPRV)Nigeria 75/1株N基因序列进行人工合成,在此基础上设计2对特异引物分别对N1、N5基因扩增和对N1和N5基因进行搭桥PCR连接,经测序分析后将N1-N5基因片段和原核表达载体pET-32a(+)相连接,构建pET-32a-N1-N5质粒。将pET-32a-N1-N5转化于TransB(DE3)原核表达感受态细胞后用IPTG诱导表达,将纯化重组蛋白进行SDS-PAGE分析和Western-blot鉴定。结果表明,所表达蛋白以可溶性形式表达并具有能与PPRV阳性标准血清发生特异性反应,为建立快速检测小反当兽疫病毒抗体水平诊断方法奠定基础。
- 祁光宇刘斌陈晓宇王赛错苟慧天黄银君穆克斌刘学荣
- 关键词：小反刍兽疫病毒SDS-PAGEWESTERN-BLOT
