国家高技术研究发展计划(2008AA10Z411)
- 作品数：16 被引量：95H指数：7
- 相关作者：李刚史利军张坤邱文英李伟更多>>
- 相关机构：中国农业科学院北京畜牧兽医研究所中国农业大学兰州军区兰州总医院更多>>
- 发文基金：国家高技术研究发展计划中央级公益性科研院所基本科研业务费专项“十一五”国家科技支撑计划更多>>
- 相关领域：农业科学医药卫生生物学更多>>
- 检测猪圆环病毒2型抗体SPA胶体金免疫层析方法的建立
- 采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金颗粒,并将其标记SPA,将金标SPA包被至玻璃纤维膜上,将PCV-2 Cap蛋白、抗SPA抗体分别包被至硝酸纤堆素膜的检测线与质控线上,建立了一种检测PCV-2抗体的胶体金免疫层析方法。检测...
- 范晓娟李刚史利军张锦秀李伟
- 关键词：猪圆环病毒2型胶体金免疫层析抗体检测葡萄球菌蛋白A
- 文献传递
- 小反刍兽疫病毒N基因重组杆状病毒的构建及间接ELISA抗体检测方法的建立被引量：9
- 2010年
- 本研究旨在建立基于真核表达的小反刍兽疫病毒(PPRV)N蛋白的诊断小反刍兽疫的间接ELISA方法。利用Bac-to-Bac杆状病毒-昆虫表达系统,构建含有PPRV N基因的重组供体质粒pFastBacHTA-N,转化E.coliDH10Bac感受态细胞,得到重组穿梭质粒pBacmid-PPRV-V,转染昆虫细胞Sf21,获得含有PPRV N基因的重组杆状病毒。用重组病毒感染昆虫细胞后,SDS-PAGE鉴定出60ku左右的表达蛋白,Western blot检测该蛋白具有很好的反应原性。以重组Bacmid-PPRV-N蛋白作为包被抗原,建立间接ELISA检测方法。临床检测来自西藏疫区的37份山羊血清和来自青海省非疫区的92份山羊血清,与法国蒙彼利埃农学发展研究国际合作中心(CIRAD-EMVT)提供的竞争ELISA试剂盒相比较,特异性为96.2%,敏感性为100%,二者的符合率达到96.9%。结果表明本研究建立的间接ELISA方法可以很好地用于小反刍兽疫的临床诊断。
- 李伟李刚吴晓东邱文英张坤Hermann Unger
- 关键词：小反刍兽疫病毒杆状病毒昆虫细胞间接ELISA
- 小反刍兽疫病毒F蛋白的原核表达及其多克隆抗体的制备被引量：5
- 2012年
- 目的原核表达小反刍兽疫病毒(Peste des petits ruminants virus,PPRV)F蛋白,并制备多克隆抗体。方法根据GenBank中登录的PPRV Nigeria 75/1株F基因全长序列,采用DNAStar软件设计去除F基因信号肽和跨膜区的引物,进行RT-PCR扩增,并克隆至原核表达载体pET-32a(+)中,转化E.coli BL21(DE3),经IPTG诱导表达。表达的重组蛋白纯化后,进行SDS-PAGE和Western blot分析,免疫BALB/c小鼠,制备多克隆抗体,并初步应用于PPRV的检测。结果重组原核表达质粒pET-32a(+)-PPRV-F经双酶切和测序证实构建正确;表达的重组F蛋白相对分子质量约59 000,诱导6 h表达量最高,且主要以包涵体形式表达;纯化的重组蛋白纯度可达95%以上;免疫小鼠制备的多抗能与纯化的重组蛋白发生特异性反应,抗体效价高于1∶64 000;间接免疫荧光试验显示,制备的多抗能够识别PPRV Nigeria 75/1株全病毒抗原。结论原核表达了PPRVF蛋白,并制备了高效价的多克隆抗体,为其进一步研究及小反刍兽疫临床快速检测方法的建立奠定了基础。
- 田康乐李刚邱文英程朝飞
- 关键词：小反刍兽疫病毒F蛋白原核细胞基因表达多克隆抗体
- 减蛋综合征病毒NE4株全基因组序列测定与分析
- 2010年
- 根据减蛋综合征病毒(EDSV-76)AV-127株的全基因序列(序列号BK000404),用Premier5.0软件设计22对引物,利用PCR方法对EDSV-76病毒NE4株的全基因组进行了分段扩增、克隆和序列测定,并用DNAStar分析软件对各片段的测序结果进行拼接,将该序列与GenBank中已登录的相应序列进行同源性分析,并用六邻体蛋白构建进化树.结果表明:NE4株基因组序列全长33214bp,GC含量为43%,与国际标准株AV-127相比,核苷酸序列同源性为99.6%.碱基的插入或缺失主要在非编码区,在100K蛋白编码区距羧基端1/10处插入了1个碱基C,其ORF编码696个氨基酸,而AV-127株100K蛋白编码709个氨基酸,预计其发挥功能的基团在N端.蛋白同源性分析表明,EDSVNE4株主要蛋白与羊腺病毒OAV(Ovine adenovirusD)、牛腺病毒BAV(Bovine adenovi-rusD)和蛇腺病毒SAV(Snake adenovirus)有较高的同源性,而与禽腺病毒Ⅰ群(CELO)的同源性较低,说明NE4株与禽腺病毒Ⅰ群亲缘关系较远,进化树分析也证实了此特性.
- 董春娜李刚邱文英张坤哈小琴
- 关键词：减蛋综合征病毒基因组同源性
- 狂犬病病毒基质蛋白的原核表达及其间接ELISA方法的建立被引量：8
- 2013年
- 目的以原核表达的狂犬病病毒M蛋白作为检测抗原,建立间接ELISA方法用来检测狂犬病病毒抗体。方法为表达狂犬病病毒(RV)基质蛋白(M),采用RT-PCR方法从狂犬病病毒Flury-LEP株中扩增RV基质蛋白基因,双酶切后定向克隆至原核表达载体pET-32a(+),构建重组质粒pET-M。将重组质粒pET-M转化至宿主菌E.coli Rosetta中进行表达。SDS-PAGE和Western blot分析确定蛋白表达量和特异性。用纯化的重组M蛋白作为包被抗原建立检测犬RV抗体的间接ELISA方法,通过优化反应条件,确定抗原最佳包被量、血清的最佳稀释度、Protein A-HRP的最佳稀释度。结果经PCR、双酶切及测序鉴定,重组质粒pET-M构建成功,将重组质粒进行转化后诱导表达,经SDS-PAGE电泳分析得到高效表达的M蛋白,重组蛋白可被RV阳性血清特异性识别,表明基质蛋白具有良好的反应原性。用表达的狂犬病病毒M蛋白建立了检测RV抗体的间接ELISA方法,用该间接ELISA方法与以狂犬病病毒作为诊断抗原的商品化ELISA试剂盒分别对93份临床血清样品进行检测,结果两者的符合率为89.2%。结论用原核表达的重组M蛋白作为包被抗原建立的间接ELISA方法可用做检测犬RV抗体水平的参考。
- 宫苗苗曾妮程朝飞李刚
- 关键词：狂犬病病毒基质蛋白原核表达蛋白纯化酶联免疫吸附试验
- 猪圆环病毒2型间接ELISA抗体检测试剂盒的研制及初步应用被引量：7
- 2011年
- 以大肠杆菌原核表达系统表达的猪圆环病毒2型Cap蛋白为抗原,建立猪圆环病毒2型间接ELISA检测方法,优化ELISA反应条件,研制猪圆环病毒2型ELISA抗体检测试剂盒。与商品化试剂盒相比,该检测试剂盒敏感性、特异性和符合率分别为95.12%、92.86%和94.55%;同时与猪圆环病毒1型(PCV1)、猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)等多种病毒阳性血清无交叉反应。试剂盒具有较好的重复性,在-20℃至少可保存1年以上,将其应用于临床血清样品的检测,结果安徽、广东、广西采样猪场的PCV2阳性率分别为100%、48.39%、100%。
- 胡小华李刚史利军张坤贾凤芹
- 关键词：猪圆环病毒2型CAP蛋白间接ELISA抗体检测试剂盒
- 减蛋综合征病毒环介导等温扩增检测方法的建立被引量：3
- 2011年
- 根据GenBank登录的减蛋综合征病毒(EDSV)六邻体基因的保守区,设计了3对环介导等温基因扩增(LAMP)引物,优化反应体系,并对其灵敏性、特异性进行验证.结果表明:LAMP优化后的反应体系为外引物浓度0.1μmol·L-1,内引物浓度0.8μmol·L-1,环引物浓度0.4μmol·L-1,Mg2+浓度8.0 mmol·L-1,dNTP浓度0.8 mmol·L-1,甜菜碱浓度0.5 mmol·L-1,BstDNA聚合酶浓度8 U,最佳反应温度65℃;扩增出的EDSV基因呈特征性梯状条带,显色反应呈绿色荧光;检测EDSV的灵敏度高,是普通PCR检测的10倍,可检测到60个拷贝的基因组DNA;特异性强,与鸡新城疫病毒(NDV)、传染性法氏囊病毒(IBDV)、传染性支气管炎病毒(IBV)、鸡胚致死孤儿病毒(CELO)无交叉反应;该方法重复性好,稳定性高,可准确快速地进行减蛋综合征病毒的检测.
- 董春娜李刚李伟张坤史利军哈小琴胡永浩
- 关键词：减蛋综合征病毒环介导等温扩增
- 快速检测小反刍兽疫病毒RT-LAMP方法的建立被引量：25
- 2009年
- 本研究采用一步法反转录环介导等温扩增技术(RT-LAMP)建立了一种快速、灵敏、高度特异的检测小反刍兽疫病毒(PPRV)的方法。针对PPRV-N基因保守区域设计4条引物,在Bst大片段聚合酶的作用下,可以实现DNA的梯状等温扩增。优化RT-LAMP的反应体系,并检验其灵敏性、特异性。一步法RT-LAMP检测方法从核酸抽提到检测结果出现仅需70 min,该方法具有良好的特异性,与同属的犬瘟热病毒无交叉反应,灵敏度是RT-PCR的1 000倍,是巢式RT-PCR的100倍。结果证明,RT-LAMP方法可快速、灵敏、特异、经济地检测PPRV,在基层和实验室都具有良好的应用前景。
- 李伟李刚范晓娟张坤贾风琴史利军Hermann Unger
- 关键词：小反刍兽疫病毒核酸检测
- 猪圆环病毒Ⅱ型修饰Cap蛋白基因的原核表达及纯化
- 2009年
- 目的:本研究基于原核表达系统表达猪圆环病毒Ⅱ型(PCV-2)Cap蛋白。方法:PCV-2ORF2基因编码的Cap蛋白含有能产生免疫反应的多个抗原表位,本研究针对Cap蛋白基因设计引物,去掉核定位信号肽的核苷酸序列克隆到原核表达载体pET-32a(+)中,筛选重组菌并进行原核表达、鉴定及纯化。结果:纯化后的修饰Cap蛋白是能够与猪圆环病毒Ⅱ型的阳性血清发生特异性反应。结论:表达的重组修饰Cap蛋白可以作为标准抗原蛋白用于PCV-2的检测。
- 张锦秀晁生玉史利军候绍华李刚
- 关键词：核衣壳蛋白纯化
- 猪圆环病毒Ⅱ型修饰Cap蛋白基因的原核表达及纯化
- 目的:本研究基于原核表达系统表达猪圆环病毒Ⅱ型(PCV-2)Cap蛋白.方法:PCV-2 ORF2基因编码的Cap蛋白含有能产生免疫反应的多个抗原表位,本研究针对Cap蛋白基因设计引物,去掉核定位信号肽的核苷酸序列克隆到...
- 张锦秀晁生玉史利军候绍华李刚
- 关键词：核衣壳蛋白纯化
- 文献传递
