国家科技支撑计划(2009BAI87B02)
- 作品数：13 被引量：34H指数：4
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- 神经来源天然细胞外基质的制备方法及生物相容性评价被引量：3
- 2010年
- 目的细胞外基质(extracellular matrix,ECM)因其良好的生物安全性和生物相容性,以及具有细胞识别及黏附位点等优势而广泛用作组织工程支架材料。探讨神经来源天然ECM的制备方法及用于神经组织工程支架的可行性。方法收集新鲜犬坐骨神经10根,采用低渗冻融、机械粉碎、差速离心法制备神经ECM。采用扫描电镜观察其形态特征;Ⅰ型胶原、层粘连蛋白、纤维连接蛋白免疫荧光染色观察其组成成分,并用Hoechst33258荧光染色检测其去细胞程度;行天狼猩红、番红O、甲苯胺蓝染色,对其成分进行定性分析;采用生化定量检测神经ECM中总胶原和葡萄糖胺聚糖(glycosaminoglycan,GAG)的含量;将大鼠背根神经节和大鼠雪旺细胞分别与神经ECM膜共培养,采用免疫荧光染色观察神经组织以及细胞在ECM膜上的生物相容性。结果扫描电镜观察示神经ECM为直径30～130nm的二维纳米微丝。免疫荧光染色示Ⅰ型胶原、层粘连蛋白、纤维连接蛋白染色均呈阳性;Hoechst33258荧光染色提示神经ECM去细胞完全。组织化学染色示天狼猩红、番红O、甲苯胺蓝染色均呈阳性。生化成分定量检测神经ECM总胶原含量为(114.88±13.33)μg/mg干重,与正常神经组织的(54.07±5.06)μg/mg干重比较,差异有统计学意义(P<0.01);神经ECM的GAG含量为(17.52±2.34)μg/mg干重,与正常神经组织的(25.25±1.56)μg/mg干重比较,差异无统计学意义(P>0.05)。大鼠背根神经节培养7d后,可见神经丝蛋白200免疫荧光染色呈阳性;大鼠雪旺细胞培养2d后,可见S100免疫荧光染色呈阳性。结论神经ECM富含Ⅰ型胶原、层粘连蛋白、纤维连接蛋白等成分,具有良好的细胞相容性,可作为一种理想的神经组织工程支架材料。
- 王玉彭江赵喆黄靖香赵斌张莉眭翔许文静陈继凤卢世璧
- 关键词：神经组织工程细胞外基质生物相容性背根神经节雪旺细胞
- 化学去细胞异体神经移植修复鼠全面神经的实验研究
- 2011年
- 目的利用具有"一主干多分支"特征的化学去细胞同种异体神经(CEAN)修复大鼠面神经缺损并评价修复效果。方法取成年SD大鼠双侧面神经进行去细胞同种异体面神经制备和自体面神经冻融处理并进行结构评价。取成年雄性SD大鼠30只,制备大鼠左侧面神经10 mm缺损模型,随机分成3组(n=10),分别为采用自体神经移植组(A组)、去细胞同种异体面神经移植(CEANA)组(B组)和自体神经液氮冷冻组(C组),术后行大体观察和组织学观察。结果利用化学法可制备出保留天然成分和空间结构的具有"一干多支"特征的CEAN。术后12周,A组、B组有髓神经纤维总数均优于C组(P<0.05),A组与B组比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论保留天然成分和空间结构的具有"一干多支"特征的CEANA可用于修复大鼠全面神经缺损的治疗,具有同自体神经移植相似的修复效果。
- 赵斌杨昱詹胜锋彭江王玉赵喆任志午张莉许文静卢世璧
- 关键词：周围神经化学去细胞同种异体神经
- 软骨素酶ABC处理化学去细胞异体神经后的形态学观察被引量：2
- 2010年
- [目的]观察软骨素酶ABC处理化学去细胞异体神经后,硫酸软骨素蛋白多糖(CSPG)去除效果以及对活性成分层粘蛋白(Laminin)的影响。[方法]取12根新鲜猪坐骨神经,每段长60 mm,应用7%脱氧胆酸钠与7%Triton X-100制备化学去细胞异体神经后,随机分为两组。实验组(n=6):软骨素酶ABC处理组,将6根去细胞异体神经浸泡在包软骨素酶ABC(2 U/ml)的PBS(pH7.4);对照组(n=6)为PBS液浸泡。两组处理时间均为16 h37℃水浴。分别对两组神经行HE染色以及CSPG、Laminin免疫荧光染色观察。[结果]实验组与对照组HE纵切片均未能观察到细胞,红染的神经基底膜呈波浪状纵形排列,轴突消失而形成管柱状空隙;对照中CSPG免疫荧光染色阳性,经软骨素酶ABC处理后CSPG免疫荧光染色阴性;而实验组和对照组基底膜管成分层粘蛋白免疫荧光染色显示为阳性。[结论]经软骨素酶ABC处理的去细胞异体神经特异性降解了不利于神经生长的成分CSPG,而对去细胞神经中促神经生长成分Laminin无影响,可能是修复周围神经缺损的良好的移植物。
- 赵斌王玉彭江张莉赵喆许文静卢世璧
- 关键词：化学去细胞异体神经组织学观察
- 化学去细胞异体神经添加不同组织来源雪旺细胞对周围神经损伤修复的功能评价被引量：10
- 2010年
- 目的构建不同组织来源雪旺细胞(Schwann cells,SCs)及化学去细胞异体神经(chemically extracted acellular nerve allograft,CEANA)移植物,比较其修复周围神经缺损的效果。方法 4周龄SD大鼠3只,体重80～120g,体外培养、扩增和鉴定BMSCs及脂肪来源干细胞(adipose-derived stem cells,ADSCs)。体外诱导BMSCs和ADSCs分化为类雪旺细胞(dMSC,dADSC),并采用胶质细胞标记物p75和抗胶原纤维酸性蛋白(glial fi brillary acidic protein,GFAP)进行鉴定。取出生3d SD大鼠10只,体重6～8g,分离培养SCs。20只成年Wistar大鼠,体重200～250g,取双侧约20mm坐骨神经制备CEANA。40只成年雄性SD大鼠,制备左侧15mm坐骨神经缺损模型,根据神经缺损修复方法不同随机分为5组(n=8):A组,取自体坐骨神经翻转后吻合;B组,取15mm CEANA吻合后补充5×105个SCs;C组,取15mm CEANA吻合后补充5×105个dMSC;D组,取15mm CEANA吻合后补充5×105个dADSC;E组,取15mm CEANA吻合。术后12周行感觉和运动功能恢复评价及组织学评价。结果 BMSCs和ADSCs表面抗原标志为CD34-、CD45-、CD90+。经诱导后BMSCs和ADSCs形态变化与SCs相似,呈双极、星形结构,SCs标记物p75和GFAP均表达阳性。术后12周,A、B、C、D、E组肢体50%回缩阈值分别为(13.8±2.3)、(15.4±6.5)、(16.9±5.3)、(16.3±3.5)和(20.0±5.3)g,A组与E组比较差异有统计学意义(P<0.01),B、C、D组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。A、B、C、D、E组小腿三头肌收缩力恢复率分别为87.0%±9.7%、70.0%±6.6%、69.0%±6.7%、65.0%±9.8%和45.0%±12.1%,A、B、C、D组与E组比较差异有统计学意义(P<0.05)。各组远端吻合口神经坚牢蓝染色显示神经纤维排列整齐,无炎性反应。甲苯胺蓝染色和透射电镜观察显示,B、C、D组有髓神经纤维计数及有髓神经纤维髓鞘厚度均大于E组,差异均有统计学意义(P<0.01);B组轴突直径大于C、D组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 CEANA补充dADSC修复周围神经缺损与补
- 赵喆赵斌王玉彭江张莉陈继凤赵庆任志午刘炎许文静卢世璧
- 关键词：化学去细胞异体神经雪旺细胞BMSCS脂肪来源干细胞
- 人脐带Wharton胶间充质干细胞的生物学特性及雪旺细胞分化研究被引量：1
- 2010年
- [目的]研究人脐带Wharton胶间充质干细胞(WJMSCs)的生物学特性及向雪旺细胞诱导分化的可能性,为神经组织工程提供新的种子细胞。[方法]去除新鲜人脐带动、静脉和脐带外膜组织,获得Wharton胶,采用组织块培养法获得脐带Wharton胶中的干细胞,免疫荧光鉴定WJMSCs的细胞表面特异标记CD44,CD105,CD34,CD45,Stro-1,Vimentin和Nestin,评价干细胞的生物学特性;采用b-FGF和Forskolin等诱导WJMSCs向雪旺细胞分化,光镜观察诱导后细胞形态的变化;免疫荧光染色鉴定雪旺细胞特异性标记物p75和GFAP的表达;Western分析诱导前后雪旺细胞特异性标记物GFAP的表达。[结果]分离培养的WJMSCs免疫荧光染色CD44、CD105、Stro-1和Vi-mentin表达阳性,而CD34、CD45和Nestin表达阴性,具有间充质干细胞的生物学特性;WJMSCs经过胶质细胞生长因子的作用,光镜下发现诱导的细胞形态与雪旺细胞相似;免疫荧光染色p75和GFAP阳性;Western结果显示诱导的雪旺细胞标记物GFAP表达阳性。[结论]人脐带Wharton胶间充质干细胞可诱导分化成为雪旺样细胞,其表型和分子特征与雪旺细胞相似,诱导分化的人脐带Wharton胶间充质干细胞是一种理想的神经组织工程的种子细胞。
- 王玉张莉彭江赵斌陈继凤赵喆许文静卢世璧
- 关键词：脐带间充质干细胞雪旺细胞
- 化学去细胞异体神经周围复合BMSCs生物蛋白胶复合物促周围神经缺损修复被引量：6
- 2011年
- 目的将BMSCs复合在化学去细胞异体神经(chemical extracted acellular nerve allograft,CEANA)周围,观察对CEANA修复周围神经缺损效果的影响。方法成年雄性C57小鼠21只,体重25～30g;成年雄性Balb/c小鼠15只,体重25～30g。取Balb/c小鼠双侧坐骨神经,制备CEANA。取C57小鼠3只,分离培养BMSCs,取5×106个第3代BMSCs添加到500μL生物蛋白胶制备BMSCs生物蛋白胶复合物,共培养3、7、14、21d后,分别取其上清与PC12细胞共培养,观察对PC12细胞的影响。取成年雄性C57小鼠18只,制备小鼠左侧坐骨神经10mm缺损模型,随机分成3组(n=6),分别采用自体神经移植复合生物蛋白胶(A组)、CEANA移植复合BMSCs生物蛋白胶复合物(B组)、CEANA移植复合生物蛋白胶(C组)修复坐骨神经缺损;实验动物右侧切开暴露坐骨神经,作为正常对照。术后行大体观察;术前及术后2、4、6、8周测量小鼠坐骨神经指数(static sciatic index,SSI);术后8周取材计算术侧小腿三头肌湿重恢复率并行小腿三头肌Masson染色观察,吻合口远端神经行甲苯胺蓝染色和透射电镜观察。结果 BMSCs在生物蛋白胶内均匀分布,外观呈球形,培养3d后可见BMSCs呈多个长突起。加入BMSCs生物蛋白胶复合物共培养3、7、14、21d的上清,PC12细胞均分化为类神经元样细胞。术后各组动物切口愈合良好。各组SSI随时间延长逐渐增加,术后4、6、8周A组SSI均高于B、C组,差异有统计学意义(P<0.05);B组略高于C组,但差异无统计学意义(P>0.05)。术后8周,B组小腿三头肌湿重恢复率、有髓神经纤维总数均优于C组,但较A组差,差异有统计学意义(P<0.05);B组小腿三头肌纤维面积、髓鞘厚度均优于C组(P<0.01),而与A组比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论在CEANA周围添加BMSCs生物蛋白胶复合物可提高周围神经损伤修复效果。
- 赵喆王玉彭江赵斌赵庆刘炎任志午詹胜峰张莉许文静卢世璧
- 关键词：化学去细胞异体神经BMSCS神经营养因子神经修复
- 生物蛋白胶作为骨髓间充质干细胞移植载体的体外相容性研究被引量：4
- 2012年
- [目的]构建骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)-生物蛋白胶复合体评价其生物相容性,探讨其作为种子细胞载体的可行性。[方法]本实验分为两组,实验组5×107骨髓间充质干细胞(BMSCs)与生物蛋白胶相混制备MSC-生物蛋白胶复合体,空白组骨髓间充质干细胞(BMSCs)。通过Dead/live染色观察两组的细胞形态及21 d内细胞的存活情况,同时分别在1、3、7、14 d各取上清进行Elisa检测并计算其分泌释放NGF和BDNF的浓度。[结果]实验组培养3 d后光镜下观察呈多个突起,细胞形态良好,空白组呈菱形和多角形;Dead/live染色结果提示体外培养1 d,两组细胞的存活率都在90%,比较无差异,无统计学意义(P﹥0.05),7、14、21 d两组细胞的存活率有差异,具统计学意义(P﹤0.05),存活率在60%以上;Elisa检测结果显示两组中NGF在1 d时有差异,具统计学意义(P﹤0.05),3、7、14 d时NGF和BDNF的含量比较无统计学意义(P﹥0.05),结果显示生物蛋白胶对MSC分泌的细胞因子NGF和BDNF的释放没有明显影响。[结论]生物蛋白胶是一种理想的可用于临床的细胞载体,具有良好的生物相容性,BMSCs-生物蛋白胶复合体能持续稳定的释放神经生长因子BDNF和NGF。
- 陈继凤彭江张莉赵喆王玉许文静
- 关键词：生物蛋白胶MSCS细胞载体
- 不同种属颅外段面神经结构的比较被引量：2
- 2011年
- 目的通过比较鼠、兔、犬、人颅外段的面神经主干及各分支的解剖学和组织学结构,总结"一干多支"周围神经的特点。方法在外科显微镜下解剖、分离出鼠、兔、犬、人的颅外段面神经主干及颞支、颧支、颊支、下颌缘支、颈支5个分支,各20根全面神经,分别进行石蜡切片HE染色,半薄切片甲苯胺蓝染色,超薄切片电镜观察,运用图像分析软件Image.pro.plus.5.0,分别记录各种属面神经主干及各分支的神经直径、神经分束、轴突直径、髓鞘厚度等结构特点。结果面神经直径鼠<兔<人<犬;面神经分束,鼠2～4束,兔2～6束,人5～9束,犬各分支均只有1束;轴突直径鼠<兔<犬<人;髓鞘厚度鼠<兔<犬<人。结论不同种属的"一干多支"神经具有不同的特点。
- 赵斌龙璇杨昱任志午彭江王玉张莉许文静赵喆詹胜锋卢世璧赵庆
- 关键词：面神经周围神经神经解剖学
- 不同数量BMSCs对大鼠背根神经节生长影响的实验研究被引量：2
- 2011年
- 目的 BMSCs作为雪旺细胞的替代细胞可提高周围神经损伤修复效果,但目前对于神经支架内添加适宜的种子细胞数量未达成共识。研究不同数量BMSCs对大鼠背根神经节(dorsal root ganglion,DRG)生长的影响。方法取4周龄雄性SD大鼠3只,体重80～100 g,体外培养扩增BMSCs。取新生1～2日龄SD大鼠3只,雌雄不限,体重4～6 g,制备DRG。取第3代BMSCs制备BMSCs-生物蛋白胶复合物,按照加入细胞数量的不同,将实验分为A组(1×103个)、B组(1×104个)、C组(1×105个)和D组(0个),并与SD大鼠DRG共培养。48 h后通过形态学观察,神经丝蛋白200和雪旺细胞S-100免疫荧光染色,对SD大鼠DRG轴突生长长度、雪旺细胞迁移距离和轴突面积指数进行定量评价。结果 48 h后可见各组BMSCs生长出多个长突起;雪旺细胞移行和轴突从DRG长出,呈多方向性生长;BMSCs生物蛋白胶具有生物活性且影响DRG生长。A、B、C组DRG轴突生长长度及雪旺细胞迁移距离均明显大于D组(P<0.05),C组小于B组(P<0.05),A、C组间及A、B组间差异无统计学意义(P>0.05)。A、B组轴突面积指数明显大于D组(P<0.05),C组大于D组但差异无统计学意义(P>0.05),A、B、C组间差异无统计学意义(P>0.05)。结论乳鼠DRG体外培养实验,可作为研究周围神经损伤修复的体外模型。不同数量BMSCs生物蛋白胶复合物对DRG生长的影响具有量效关系,为组织工程神经选用合适数量BMSCs提供了理论依据。
- 许文静赵喆赵斌王玉彭江张莉陈继凤卢世璧
- 关键词：背根神经节BMSCS神经再生组织工程神经
- 大鼠脂肪干细胞向雪旺细胞诱导分化能力的研究被引量：4
- 2011年
- 目的:研究脂肪干细胞(ADSCs)向雪旺细胞的诱导分化,为神经组织工程提供新的种子细胞。方法:取SD大鼠项背处的皮下脂肪,分离出脂肪干细胞并培养传代,流式细胞仪检测细胞表面特异标记CD29,CD34,CD44,CD45,CD90,以评价干细胞的生物学特性;采用b-FGF和forskolin等诱导脂肪干细胞向雪旺细胞分化,光镜观察诱导后细胞形态的变化;免疫荧光染色鉴定雪旺细胞特异性标记物S100、P75和GFAP的表达;PCR检测诱导前后雪旺细胞特异性标记物S100、P75的表达。结果:分离培养的鼠脂肪干细胞CD29、CD90表达呈阳性,而CD34、CD44和CD45表达呈阴性,具有脂肪干细胞的生物学特性;脂肪干细胞经过胶质细胞生长因子的作用,光镜下发现诱导的细胞形态与雪旺细胞相似;免疫荧光染色S100、P75和GFAP阳性;RT-PCR结果显示诱导的雪旺细胞标记物S100和P75表达上调。结论:脂肪干细胞可诱导分化成雪旺细胞,其表型和分子特征与雪旺细胞相似,诱导分化的脂肪干细胞是一种理想的神经组织工程的种子细胞。
- 任志午赵喆王玉陈继凤詹胜锋刘炎许文静张莉彭江卢世璧
- 关键词：脂肪干细胞雪旺细胞诱导分化
