农业部全国畜牧总站动物胚胎工程及分子育种湖北省重点实验室开放课题(2010ZD163)
- 作品数：2 被引量：5H指数：1
- 相关作者：郑新民毕延震刘西梅乔宪凤欧阳辉武更多>>
- 相关机构：湖北省农业科学院中山大学附属第三医院武汉大学更多>>
- 发文基金：转基因生物新品种培育专项农业部全国畜牧总站动物胚胎工程及分子育种湖北省重点实验室开放课题更多>>
- 相关领域：生物学医药卫生更多>>
- 一种高效的单质粒模式四环素诱导表达系统的构建被引量：1
- 2012年
- 现有的四环素诱导调控系统基于两个单独的质粒分别表达反式结合蛋白和外源基因.其缺点是在建立转基因定量表达动物模型时,需要制备和维持两个动物品系,再进行杂交才有可能获得双转基因后代,步骤繁琐,难度较大.针对上述缺陷,本研究尝试将反式蛋白rtTA表达框和低背景响应元件Ptight组装到同一个载体上,构建为严谨型单载体模式的诱导表达系统pTRE-Tight-rtTA,并通过两种报告基因的表达对其调控活性进行了研究.含有荧光素酶和绿色荧光蛋白的pTRE-Tight-rtTA-Luc和pTRE-Tight-rtTA-EGFP报告载体分别转染猪肾PK15细胞并经强力霉素处理,均可成功诱导报告基因的定量表达.在等摩尔转染条件下,单载体系统的诱导效率明显高于双载体系统(Dox-1 000 ng,10倍;Dox-10 000 ng,8倍).该诱导型单载体系统的成功构建为外源基因的定量表达提供了新手段,为转基因定量表达动物模型的研究提供了新策略.
- 马卓乔宪凤郑新民周荆荣刘西梅许丽毕延震
- 关键词：TET-ON报告基因四环素
- 检测miRNA活性的双荧光素酶单载体被引量：4
- 2012年
- 本研究报道了微小RNA靶分子鉴定及其活性分析的内参内置型双荧光素酶单载体与其应用.利用非连接酶依赖的基因克隆技术,借助一步式二元搭桥耦联长距离PCR及大肠杆菌体内同源重组方法,将萤火虫荧光素酶基因(Firefly luc)融合到pRL-TK载体的海肾荧光素酶基因(Renillaluc)和氨苄青霉素抗性基因之间,构建为两种荧光素酶基因表达框并置的单载体报告系统,命名为pMiSensor.在海肾荧光素酶基因的3'非翻译区引入多克隆位点Xba I和Apa I,便于克隆目的基因的3'UTR.海肾荧光素酶为报告基因,萤火虫荧光素酶为内参基因.多种哺乳动物细胞系的转染实验证实,pMiSensor可同时有效表达两种报告基因,其酶活显示出宽广的线性范围.通过构建pMiSensor-CCNE1报告载体,证明pMiSensor能够重现miR16对细胞周期蛋白CCNE1的调控作用.通过转染miR16抑制剂,证明pMiSensor-CCNE1可作为一种灵敏的生物感应器,探测细胞内微小RNA的活性变化.该双荧光素酶单载体具有重复性高、操作简便、定量准确的优点,适用于微小RNA靶分子的筛选、鉴定和确认,也适用于在细胞水平定量分析微小RNA的活性变化.
- 毕延震郑新民邵长伟潘雯姜黎欧阳辉武乔宪凤刘西梅
- 关键词：微小RNA荧光素酶
