国家自然科学基金(21176106)
- 作品数：13 被引量：41H指数：4
- 相关作者：孙付保张震宇岳春蔡宇杰廖祥儒更多>>
- 相关机构：江南大学南阳理工学院河南天冠企业集团有限公司更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金中国博士后科学基金国家重点实验室开放基金更多>>
- 相关领域：轻工技术与工程化学工程生物学动力工程及工程热物理更多>>
- sucA缺失型大肠杆菌菌株的构建与发酵条件优化
- 2018年
- 反式-4-羟脯氨酸在多领域具有重要应用价值。为了进一步提高反式-4-羟脯氨酸的产量,在已构建好的E. coli BL21(DE3)△putA的基础上,敲除基因sucA的同时插入密码子优化后的反式-4-羟化酶基因(hyp),并将构建好的质粒pUC19-ptrp2-hyp-vgb导入该基因敲除菌株中。之后在摇瓶水平上,单因素优化发酵条件与发酵培养基的组分,并通过正交实验进一步确定敲除菌株的培养条件。结果表明:与含有同样质粒的原菌和两种单敲除菌E. coli BL21(DE3)△sucA、E. coli BL21(DE3)△putA相比,E. coli BL21(DE3)△putA△sucA双敲除菌具有最高的全细胞酶活,大约是原菌的2.6倍;在摇瓶水平上,发酵条件优化后,以100 mmol/L的L-脯氨酸为底物进行发酵,12 h后可得到1.08 g/L的羟脯氨酸,是优化前的3.87倍。
- 林凡张震宇张震宇孙付保
- 关键词：透明颤菌血红蛋白重组大肠杆菌
- 酶法产L-丙氨酰-L-谷氨酰胺重组大肠杆菌pepD/pepN基因的敲除及其发酵优化被引量：2
- 2016年
- L-丙氨酰-L-谷氨酰胺(L-alanyl-L-glutamine,L-Ala-L-Gln),是目前国内外公认的L-谷氨酰胺载体,在临床医学和营养学等领域有广泛应用。为了减少丙谷二肽在生物酶法生产过程中菌体对其降解,利用λRed同源重组系统,敲除大肠杆菌中肽酶D和氨肽酶对应的编码基因。与野生型菌株相比,双敲除突变菌株的全细胞酶活提高了0.29倍。对该菌株进行摇瓶发酵优化,得到最优培养基为(g/L):葡萄糖12、酵母提取物10、胰蛋白胨10、(NH_4)_2SO_4 1、KH_2PO_4 3、K_2HPO_4 1、MgSO_4 0.2;最优发酵温度为27℃;最佳反应条件为:Gln 200 mmol/L、Ala-Ome·HCl 200 mmol/L,反应p H 8.5,反应温度25℃。在最优条件下发酵36 h,丙谷二肽产量达到了14.51g/L反应液,是优化前的4.74倍。
- 刘沛沛张震宇孙付保周豪
- 关键词：生物酶法RED同源重组发酵优化
- 嗜热棉毛菌木糖苷酶Xyl43基因优化及其在毕赤酵母中高效表达被引量：4
- 2017年
- 【目的】通过外源表达手段构建重组毕赤酵母实现木糖苷酶的高效表达。【方法】基于毕赤酵母密码子偏好性优化嗜热棉毛菌β-木糖苷酶(Xyl43)基因密码子,将其导入毕赤酵母GS115中实现分泌表达,并对重组木糖苷酶酶学性质进行分析。通过单因素实验优化高产菌株的摇瓶发酵条件,并在5 L发酵罐中进行扩大培养。【结果】Xyl43基因优化后的序列中222个碱基发生改变,G+C含量由52.8%降低到44.6%,序列一致性为78.17%;将构建的表达载体p PIC9K-Opt Xyl43电击转入毕赤酵母中,利用平板初筛和摇瓶复筛获得一株高效表达重组菌(命名为P.pastoris GS115-Xyl43);其所产重组木糖苷酶大小为51.5 k D,动力学参数Km为2.93 mmol/L、Vmax为157.9μmol/(min·mg),最适反应温度55°C,最适p H 7.0,在p H 6.0-9.5条件下具有良好的稳定性;摇瓶优化结果表明:培养基初始p H 6.0、甲醇补加浓度1.0%、培养温度28°C、摇床转速250 r/min为最佳产酶条件,在此条件下发酵144 h胞外酶活达到42 U/m L(蛋白含量0.54 g/L);5 L发酵罐放大培养,发酵156 h(甲醇诱导96 h),木糖苷酶酶活为222.2 U/m L,蛋白含量2.36 g/L,较摇瓶提高了4.3倍。【结论】木糖苷酶在毕赤酵母中实现了高效表达,具有较好的工业化应用前景。
- 张云博白仁惠王春迪张斐洋岳春张震宇孙付保
- 关键词：Β-木糖苷酶密码子优化发酵优化毕赤酵母
- 碱性过氧化氢预处理后汽爆玉米秸秆半同步糖化发酵生产乙醇被引量：3
- 2016年
- 为了实现纤维素乙醇生产的"三高"(高浓度、高转化率和高发酵效率)指标,以复合预处理处理后的玉米秸秆为基质,探究其半同步糖化发酵工艺过程。通过对其高底物浓度预酶解过程特性考察,确定其最佳预酶解工艺为:在加酶量30 FPU/g干基质和50℃下,以15.6%(w/v)为起始基质浓度,在酶解12 h时补加相当于20%(w/v)初始基质浓度的干物料后继续酶解24 h。在最佳预酶解工艺基础上,探究了培养基成分和培养条件对乙醇发酵的影响,确定了发酵过程工艺:酵母提取物16 g/L、接种龄20 h、接种量0.6 g干菌体/L、发酵温度39℃和PEG4000 0.01 g/g干基质。在最佳的半同糖化发酵工艺下,发酵24 h后,乙醇产量达73.75 g/L,发酵效率为3.07 g/(L·h),转化率为61%。结果表明通过补料半同步糖化发酵过程可以实现高浓度和高发酵效率双重目标,这有利于推进纤维素乙醇生产的工业化发展。
- 刘建权赵晓琴张裴洋张喆周豪岳春孙付保
- 关键词：分批补料纤维素乙醇
- 大肠杆菌中顺式-3-羟脯氨酸羟化酶的定向改造被引量：1
- 2017年
- 对以L-脯氨酸为底物,产顺式-3-羟脯氨酸(cis-3-hydroxyproline,H3P)的羟化酶基因进行定向改造。从重组菌E.coli BL21(DE3)/p ET21a-ptrp2-H3P出发,通过易错PCR随机突变和定点突变处理,利用多孔板和创建的简易显色法相结合的高通量方法筛选出2株H3P高产菌P-2-H3、P-9-D5。经基因测序后得到5个突变位点R58C、T83I、H89Y、F109Y、Y119I,并在出发菌基础上对此5个位点进行单一定点突变,得到5个突变体TBTR58C、TBT-T83I、TBT-H89Y、TBT-F109Y、TBT-Y119I。发酵24 h测其产量找出3个优势突变位点。以TBT-R58C为出发菌,依次对另外2个位点进行定点突变。得到TBT-R58C-T83I-H89Y突变体。发酵24 h产量达到了1125.3 mg/L。与重组菌相比,TBT-R58C-T83I-H89Y的产量提高了53.6%。
- 黄建华王晓姣魏照辉张震宇孙付保
- 关键词：重组大肠杆菌易错PCR
- Cellic CTec2水解常压甘油自催化预处理麦草的特性探讨
- 2015年
- 目前市场上商业纤维酶制剂产品很多,不同来源纤维素酶的基质适应性各不相同,所以产糖效果也存在显著差异。为了探究Cellic CTec2(CTec2)这种商业纤维素酶水解木质纤维素的特性,本文通过对酶解率测定探究了CTec2水解甘油预处理麦草的特性。研究发现,CTec2在2%浓度基质上酶解率远远高于其它三种商业纤维素酶-Celluclast1.5L、GC220和Spezyme-CP,而且它们两两之间没有协同水解甘油预处理麦草的作用。CTec2在高基质浓度条件下能较快水解液化木质纤维素基质,在15%基质浓度上按酶蛋白载量为8mg/g基质时,72h酶解率达到39.06%,而同条件下的其它三种酶几乎不能使基质液化。与其它纤维素酶一样,加入适量添加剂可以提高Ctec2水解甘油预处理麦草能力,添加量为0.05g/g基质的PEG10000、吐温20和BSA Ctec2的酶解率分别提高了55.3%、42.5%和38.3%。因此,Ctec2作为一种新型商业纤维素酶制剂,在纤维基质高浓水解方面将会有着潜在的应用前景。
- 谭玲王亮燕红戴一凡周邦炜林巧文郑志永张震宇孙付保
- 关键词：麦草
- 常压甘油有机溶剂预处理甘蔗渣的浓醪酶解被引量：4
- 2017年
- 为了实现木质纤维素浓醪酶解在低酶载量时的"三高"(高浓度、高转化率和高转化效率),通过利用常压甘油有机溶剂预处理甘蔗渣为底物,筛选合适的基质质量浓度(150 g/L)、纤维素酶添加量(6 FPU/g基质)和添加剂(吐温80,30 mg/g基质)。接着采用分批补料策略使基质质量浓度达到350 g/L,考察了不同加酶方式对分批补料浓醪酶解的影响。酶解72 h酶解液葡萄糖质量浓度达到132 g/L,葡萄糖转化率达到了理论值的60%。结果表明,常压甘油有机溶剂预处理基质具有较好的可酶解性,添加吐温80可以显著提高酶解效率。常压甘油有机溶剂预处理甘蔗渣的分批补料浓醪酶解推动了纤维素乙醇浓醪发酵工业化进程。
- 洪嘉鹏岳春赵晓琴Marie Rose Mukasekuru李祥孙付保孙海彦
- 关键词：甘蔗渣分批补料
- 非离子表面活性剂对木质纤维素酶解的促进作用被引量：10
- 2011年
- 纤维素酶单位酶活力较低、酶用量较高及酶自身易失活等因素依然是木质纤维素工业生产能源和生物基产品的瓶颈性问题。本文尝试在木质纤维素基质水解时添加一些非离子型表面活性剂以减少纤维素酶用量,并对这些非离子型表面活性剂促进酶解效率提高的原因进行了初步探讨。研究发现,添加非离子性表面活性剂能提高木质纤维素的酶解,添加浓度为0.05 g/g底物,常压甘油自催化预处理麦草经过添加两种非离子表面活性剂Tween-80和PEG 6000后葡萄糖产量分别可提高20%左右;非离子表面活性剂对不含木质素的原料酶解产糖也有较大的提高,以滤纸为底物时葡萄糖产量提高近90%,以微晶纤维素为底物时分别提高70%以上;添加非离子表面活性剂使得酶解体系中扩散系数k升高,异相反应效率提高,酶促反应动力学Km值明显减小,显著提高底物对纤维素酶的亲和力。
- 孙付保娄秀平洪嘉鹏顾琴琴陈晓旭蔡宇杰廖祥儒
- 关键词：非离子表面活性剂木质纤维素纤维素酶酶解
- 血红密孔菌(Pycnoporus sanguineus SYBC-L7)色素的提取及其理化性质被引量：1
- 2013年
- 研究了一株血红密孔菌(Pycnoporus sanguineus SYBC-L7)固态发酵产色素的提取条件及色素的理化性质。结果表明:该菌株在以木屑为基质固态发酵时色素产量最高;以甲醇为提取液,在35℃水浴下40 min后可从发酵后的培养物中最大化提取该色素;所得色素溶液呈黄色,在可见光区的最大吸收波长为430 nm,该色素的热稳定性和耐酸性较好,常用的氧化剂与还原剂对其影响不大。
- 骆守鹏范晶晶毛飞君蔡宇杰廖祥儒
- 关键词：色素固态发酵血红密孔菌
- 以甘油为碳源发酵高产反式-4-羟脯氨酸菌株的选育及营养优化
- 2016年
- 以低品级甘油为碳源进行微生物发酵合成反式-4-羟脯氨酸(Trans-4-hydroxy proline,Hyp)的探索。从实验室构建的重组菌E.coli BL21(DE3)/p UC19-ptrp2-Hyp出发,通过易错PCR随机突变和常压室温等离子体复合诱变处理,利用单菌落琼脂块和氨基酸显色相结合高通量筛选出1株以甘油为唯一碳源的Hyp高产菌P71。与葡萄糖培养基相比,该菌株更适合在甘油上生长并转化L-脯氨酸合成Hyp,发酵20 h产Hyp高达1.20g/L,比生长在葡萄糖培养基上高70%以上;比其出发菌株在葡萄糖培养基上产量提高了1倍以上。通过培养基成分系统优化,发现胰蛋白胨、Fe SO4和L-脯氨酸是3大主要影响因素,最适加量分别为7.01 g/L、11.51 g/L和1.41 mmol/L;在该条件下突变菌株摇瓶发酵12 h产Hyp达1.61 g/L,比优化前提高了50%。
- 王金霞黄建华于林张震宇岳春孙付保
