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茶树类黄酮O-甲基转移酶基因的克隆及原核表达分析被引量：11: 2013年; 【目的】克隆茶树(Camellia sinensis)的一个类黄酮O-甲基转移酶基因,并对其进行生物信息学分析,构建该基因的原核表达载体,在大肠杆菌中诱导表达融合蛋白,为进一步研究其酶学特性和调控茶树中甲基化类黄酮物质的代谢机理奠定基础。【方法】采用同源克隆法,以从茶树叶片中提取的总RNA为模板,结合RT-PCR与RACE克隆技术获得该基因cDNA全长,测序正确后将该基因片段连接到原核表达载体pET-28a中,转化大肠杆菌BL21并诱导表达。【结果】该基因cDNA全长为1 246 bp,其开放阅读框为1 077 bp,编码358个氨基酸,推测的蛋白分子量为40.2 kD,理论等电点为5.62;其核苷酸编码序列与葡萄和毛果杨的类黄酮O-甲基转移酶基因相似性分别为80%和81%;经IPTG诱导和SDS-PAGE检测,所构建的原核表达载体表达的融合蛋白与预期蛋白相符合。【结论】利用RT-PCR与RACE克隆技术从茶树叶片中克隆得到了一个类黄酮O-甲基转移酶基因,成功构建了原核表达载体,并使其在大肠杆菌中得到了高效表达。; 马成英吕海鹏林智张悦郭丽谭俊峰; 关键词：茶树原核表达

EGCG甲基化衍生物酶促合成的反应条件研究被引量：4: 2012年; 以EGCG-O-甲基转移酶催化EGCG生成EGCG3′′Me、EGCG4′′Me和EGCG3′Me等3种主要的EGCG甲基化衍生物的生成量为主要指标,考察了EGCG甲基化衍生物酶促合成的反应条件。结果表明,EGCG甲基化衍生物的酶促合成最佳反应条件为:温度35℃,pH7.5,DTT和Mg2+的浓度为2 mmol/L;在该反应条件下,反应体系中EGCG3′′Me、EGCG4′′Me以及EGCG3′Me的生成量分别可达到386.39μg/mL、23.40μg/mL和107.01μg/mL。; 吕海鹏费冬梅张悦林智彭群华郭丽谭俊峰; 关键词：酶促合成

EGCG-O-甲基转移酶(EOMT)催化EGCG形成的EGCG甲基化衍生物分析被引量：6: 2012年; 研究了EGCG3′′Me、EGCG4′′Me和EGCG3′Me在正离子模式下的质谱裂解规律,并在此基础上分析了EGCG-O-甲基转移酶(EOMT)催化EGCG形成的反应产物。结果表明,EGCG-O-甲基转移酶催化EGCG后反应体系中生成了10余种不同的EGCG甲基化衍生物,主要包括EGCG3′′Me、EGCG4′′Me、EGCG3′Me、EGCG5′Me、EGCG3′′,4′′-diMe、EGCG3′′,5′′-diMe、EGCG3′,5′-diMe、EGCG3′,5′′-diMe、EGCG3′,3′′,5′′-triMe,以及EGCG5′,3′′,5′′-triMe等。; 吕海鹏费冬梅张悦林智谭俊峰郭丽; 关键词：质谱裂解

茶树氧甲基转移酶基因的克隆及原核表达被引量：3: 2013年; 获得了一类茶树氧甲基转移酶基因cDNA全长并构建了该基因的原核表达载体。以从茶树叶片中提取的总RNA为模板,结合RT-PCR与RACE克隆技术获得氧甲基转移酶(O-methyltransferase)基因cDNA全长1 280 bp,其开放阅读框为1 068 bp,编码355个氨基酸,推测的蛋白分子量为39.1 kD,理论等电点为5.68。其氨基酸序列与葡萄和蓖麻氧甲基转移酶基因相似性分别为73%、71%。将该基因片段连接到原核表达载体pET-28a中,转化大肠杆菌BL21后诱导重组蛋白的表达,经IPTG诱导,SDS-PAGE检测到1条与预测融合蛋白分子量相符的外源蛋白。; 马成英施江吕海鹏张悦谭俊峰郭丽彭群华林智; 关键词：茶树克隆原核表达

茶树EGCG-O-甲基转移酶的纯化及酶学性质被引量：1: 2013年; 对重组茶树EGCG-O-甲基转移酶进行分离纯化,并对其酶学性质进行研究。结果表明:经HisTMTrap层析纯化后,获得了纯度超过95%的重组融合蛋白,纯化倍数为22.51倍,酶活回收率为34.54%,酶比活力达到0.0186U/mg;酶分子质量约为27.6kD;该酶的最适反应温度为35℃、最适pH7.5;以表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)作为底物,酶学动力学常数Km为0.100mmol/L,Vmax为7.485mg/(L min)。; 吕海鹏张悦费冬梅林智; 关键词：茶树纯化

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中央级公益性科研院所基本科研业务费专项(2012zl053)