山东省自然科学基金(Y2007C018)
- 作品数：12 被引量：12H指数：2
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- RNA干扰联合长春新碱对U937细胞体内外生长的影响被引量：1
- 2013年
- 目的从体外和体内两个方面探讨慢病毒载体介导小发卡shRNA(short harpin RNA,shRNA)靶向沉默同源盒A10(homeoboxA10,HOXA10)基因联合长春新碱(Vincristine,VCR)对U937细胞增殖和凋亡的影响。方法将U937细胞分为干扰(KD)组、阴性对照(NC)组、空白对照(BC)组,经West-ern blot方法测定对HOXA10基因的沉默作用;MTT法检测各组细胞的IC50;流式细胞术(Flow cy-tometry,FCM)检测各组细胞的凋亡率;通过流式细胞仪分选出干扰组和阴性对照组绿色荧光蛋白(Green Fluorescent Protein,GFP)阳性的细胞,建立裸鼠AML皮下移植瘤模型(细胞活力>90%),计算干扰组的抑瘤率。结果流式细胞仪测得慢病毒对U937细胞的感染率>90%,干扰组HOXA10的蛋白水平为较BC组下降89.78%。下调HOXA10的表达水平可降低VCR对U937细胞的半数抑制浓度(half-inhibitory concentration,IC50),提高VCR诱导的U937细胞凋亡率,与对照组相比差异具有统计学意义(P<0.05)。体内实验:干扰组肿瘤组织增长受到抑制。结论慢病毒载体介导的RNA干扰下调HOXA10的表达水平可在体外和体内增强U937细胞对VCR的敏感度。
- 贾秀红张艳君李建厂徐酉华罗庆
- 关键词：HOXA10U937RNA干扰长春新碱
- AML-SCID小鼠模型的建立及鉴定
- 2013年
- 目的筛选出高表达HOXA9、HOXA10基因的急性髓系白血病(Acute myeloid leukemia,AML)细胞株,并建立AML模型,为研究HOXA9、HOXA10与AML的关系奠定基础。方法经RT-PCR检测HOXA9、HOXA10在U937、HL-60、NB4、Jurkat中的表达情况,筛选出高表达的细胞株;外周血瑞氏染色、骨髓流式细胞仪、脏器HE染色鉴定移植性U937人白血病重度联合免疫缺陷(Severe combined immunodeficiency,SCID)小鼠模型。结果 HOXA9、HOXA10在U937中均高表达,在HL-60、Jurkat中不表达(或表达水平较低),NB4高表达HOXA10;U937细胞在濒死小鼠骨髓细胞所占的比例为(20.62±9.66%)%,与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05);病理检查发现U937细胞可浸润肝、脾、肺、肾器官。结论 U937高表达HOXA9、HOXA10,是研究HOXA9、HOXA10基因与白血病关系的合适细胞株,并成功建立U937-SCID人M5型急性髓性白血病模型。
- 贾秀红张艳君
- 关键词：HOXA9HOXA10U937SCIDBEIGE
- 同源盒基因HOXA9在儿童急性白血病中的表达及其临床意义被引量：2
- 2013年
- 目的研究同源盒基因HOXA9在儿童急性白血病(AL)患儿骨髓单个核细胞中的表达,并探讨其临床意义。方法采用RT-PCR方法检测46例不同时期AL患儿HOXA9 mRNA的表达水平,以15例特发性血小板减少性紫癜(ITP)患儿作为对照。结果 46例AL患儿(52份骨髓标本)HOXA9基因阳性表达率为63%,其中急性髓细胞白血病(AML)组阳性表达率(86%)明显高于急性淋巴细胞白血病(ALL)组(35%)及对照组(13%)(P<0.05);AML组HOXA9 mRNA表达水平明显高于ALL组及对照组(P<0.05)。HOXA9在各型儿童AML中表达不同,mRNA相对表达水平依次为:M5型>M4型>M1和(或)M2型,而在M3型中未检测到表达。HOXA9在AML患儿高危组中的阳性表达水平较高。AML患儿初治组HOXA9基因阳性表达率及mRNA水平明显高于缓解组和对照组(P<0.05),而缓解组与对照组比较差异无统计学意义;未缓解组HOXA9基因表达显著高于缓解组和对照组(P<0.05)。结论 HOXA9基因高表达与AL的发生相关;AML患儿HOXA9基因表达水平明显高于ALL患儿。HOXA9基因高表达者与白血病危险程度有关,且提示预后不良。因此,HOXA9基因有望成为儿童AL诊断、治疗及判断预后的一个靶点。
- 贾秀红朱立平李建厂王翠翠
- 关键词：急性白血病儿童
- RNA干扰联合小剂量阿糖胞苷对K562细胞增殖、凋亡的影响被引量：3
- 2012年
- 目的探讨利用RNA干扰(RNAi)技术沉默同源盒(HOX)A10基因联合小剂量阿糖胞苷(Ara-C)对K562细胞增殖、凋亡的影响,为白血病的基因治疗提供实验依据。方法设计合成针对HOXA10的特异性短发卡RNA寡核苷酸链,构建pGPHI/GFP/Neo-HOXA10真核表达载体并测序,应用阳离子脂质体转染K562细胞。RNAi与小剂量Ara-C单独和联合应用后,应用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测细胞增殖能力,流式细胞术检测细胞凋亡率。结果成功构建pGPHI/GFP/Neo-HOXA10载体,并转染K562细胞,结果显示该载体能有效降低HOXA10 mRNA表达水平,HOXA10/β-actin灰度比值(ODR)为(38.86±4.49)%;RNAi联合小剂量Ara-C作用于K562细胞后,细胞增殖能力明显下降,细胞增殖抑制率(IR)为(75.58±8.11)%,与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05);荧光显微镜可见红色荧光凋亡细胞明显增加,凋亡率显著升高,可达(29.71±1.24)%,与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论靶向HOXA10的RNAi技术联合小剂量Ara-C能有效抑制K562细胞增殖,并诱导其凋亡,有望成为白血病基因治疗的新方案。
- 范文文贾秀红李建厂唐慎华朱淑霞
- 关键词：RNA干扰阿糖胞苷K562细胞白血病
- 靶向同源盒A10特异性干扰性小RNA序列的筛选及功能鉴定被引量：1
- 2011年
- 目的筛选有效干扰同源盒（HOX）A10基因表达的特异性干扰性小RNA（siRNA）序列并鉴定其功能，为利用RNA干扰技术靶向HOXA10防治肿瘤提供实验依据。方法设计合成3对针对HOXA10基因不同位点的siRNA序列，应用阳离子脂质体介导转染人肺腺癌A549细胞，采用反转录-聚合酶链反应（RT—PCR）检测HOXA10 mRNA表达，以HOXA10与β-actin灰度比值（ODR）表示相对表达水平。筛选出抑制HOXA10效果最佳的siRNA序列，应用四甲基偶氮唑盐（MTT）和流式细胞术分别检测该siRNA干扰HOXA10后对A549细胞增殖和凋亡的影响。结果3对siRNA均能抑制HOXA10的表达，其中siRNA1抑制HOXA10 mRNA的表达最为明显，ODR为（20．190±1．698）％；siRNA1对A549细胞的增殖抑制率可达（69．793±2．092）％；siRNA转染后细胞凋亡率显著提高，siRNA1诱导A549凋亡作用最为明显，凋亡率为（29．593±2．670）％。结论筛选出的siRNA1序列可有效沉默HOXA10基因的表达，并能有效抑制A549细胞增殖、促进其凋亡。
- 贾秀红范文文李建厂谢书阳
- 关键词：同源盒RNA干扰A549细胞
- RNA干扰同源盒A10表达对K562细胞增殖及凋亡的影响被引量：1
- 2012年
- 目的通过构建靶向同源盒A10（HOXA10）的真核表达载体，探讨利用RNA干扰沉默HOXAIO基因对人慢性髓系白血病细胞株K562增殖和凋亡的影响。方法根据筛选的针对HOXA10的特异性有效小干扰RNA（siRNA）序列设计合成短发夹RNA（shRNA）寡核苷酸链，构建pGPHI—GFP—Neo—HOXA10真核表达载体并测序，应用阳离子脂质体转染K562细胞。实验分为细胞对照组（仅加等量细胞及培养基），阴性对照组（脂质体转染阴性对照质粒）、实验组（脂质体转染pGPHI—GFP—Neo—HOXA10）。转染载体24h后利用RT—PCR检测各组HOXA10 mRNA表达；转染载体24、48、72h后应用MTT法检测各组细胞增殖并计算细胞抑制率；转染载体48h后应用流式细胞术检测各组细胞凋亡。结果成功构建pGPHI—GFP—Neo—HOXA10载体并转染K562细胞。与细胞对照组和阴性对照组比较，实验组转染载体能有效降低HOXA10 mRNA的表达水平[（38．86±4．49）％比（88．52±9．24）％、（86．75±7．38）％，P〈0．05]，而阴性对照组与细胞对照组比较差异则无统计学意义（P〉0．05）。与阴性对照组比较，实验组载体作用于K562细胞24、48、72h后，细胞增殖能力均明显下降，细胞抑制率明显升高[（39．92±0．74）％比（7．98±5．52）％；（55．62±1．18）％比（8．27±3．45）％；（66．30±1．26）％比（8．63±3．58）％；均P〈0．05]。实验组细胞凋亡率较细胞对照组、阴性对照组也显著升高[（22．29±1．67）％比（9．82±0．69）％、（10．14±0．96）％，P〈0．05]，而阴性对照组与细胞对照组比较差异则没有统计学意义（P〉0．05）。结论构建的真核表达载体pGPHI—GFP—Neo—HOXA10可有效沉默K562细胞中HOXA10基因的表达，能明显抑制K562细胞增殖并诱导其凋亡。
- 贾秀红范文文李建厂朱淑霞唐慎华
- 关键词：K562细胞细胞增殖凋亡
- 靶向HOXA9基因shRNA慢病毒载体对U937细胞增殖与凋亡影响观察被引量：4
- 2014年
- 目的:观察慢病毒介导的短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)沉默同源盒A9(homeobox A9,HOXA9)基因对U937细胞增殖和凋亡的影响。方法:前期从4条针对HOXA9基因的RNA干扰(RNA interference,RNAi)慢病毒载体中筛选出了1条敲减效率最高的包装成慢病毒HOXA9/GV118RNAi-LV#2。实验分为对照组(control,CON)、阴性对照组(negative control,NC)及敲减组(knock down,KD)。HOXA9/GV118RNAi-LV#2感染U937细胞5d后,FCM检测U937细胞感染效率,应用实时荧光定量PCR法检测HOXA9 mRNA的沉默效率,蛋白质印迹法检测HOXA9蛋白的表达;MTT法和绘制细胞生长曲线检测细胞增殖抑制情况;FCM检测细胞凋亡及细胞周期;RT-PCR法检测细胞c-myc mRNA及p27mRNA表达情况。结果:慢病毒感染效率>90%,KD组细胞中HOXA9mRNA的沉默效率>55%,HOXA9蛋白的表达量明显减少,其中KD组相对表达水平达(0.223±0.024),显著低于NC组(0.884±0.009)及CON组(0.891±0.013),差异有统计学意义,F=1 566.202,P<0.001。MTT结果显示,KD组细胞的IR值为(40.469±1.756)%,明显高于NC组及CON组(F=1 311.928,P<0.001),细胞生长曲线表明该组细胞生长速度减慢;FCM结果显示,KD组、NC组及CON组凋亡率分别为(26.762±2.245)%、(6.819±0.547)%和(6.113±0.349)%,KD组与NC组(q=25.501,P<0.001)及CON组(q=26.418,P<0.001)比较差异均有统计学意义,提示该载体显著增加细胞凋亡率;其细胞周期G0/G1期细胞比例较CON组及NC组明显增加,提示该载体使细胞周期阻滞于G0/G1期,F=27.769,P=0.001;RT-PCR结果表明,U937细胞KD组较CON组及NC组c-myc mRNA表达水平下降,p27mRNA表达水平上升。结论:靶向HOXA9基因shRNA慢病毒载体能稳定沉默HOXA9表达,可显著抑制U937细胞增殖并促进其凋亡,同时可下调c-myc表达,上调p27表达,使细胞周期阻滞于G0/G1期。
- 贾秀红朱立平李建厂
- 关键词：HOXA9白血病慢病毒RNA干扰U937
- Hoxa10真核表达载体增强K562细胞对柔红霉素敏感度的研究
- 2012年
- 目的构建高效干扰Hoxa10基因表达的shRNA真核载体,探讨其对人慢性髓系白血病细胞株K562对化疗药物柔红霉素(daunorubicin,DNR)敏感度的影响。方法设计合成针对Hoxa10的特异性shRNA寡核苷酸链,构建真核表达载体pGPHI/GFP/Neo-Hoxa10并测序,应用阳离子脂质体转染K562细胞。实验分三组:正常对照组、阴性对照组、实验组(分别为正常K562细胞、阴性对照质粒转染K562细胞、pGPHI/GFP/Neo-Hoxa10转染K562细胞),三组细胞均加入不同浓度的DNR。RT-PCR检测Hoxa10 mRNA的表达,应用MTT检测各组细胞对DNR的敏感度,流式细胞术检测细胞凋亡率。结果成功构建pGPHI/GFP/Neo-Hoxa10载体并转染K562细胞,该载体能有效降低Hoxa10mRNA表达水平ODR=(38.864±4.488)%;MTT结果显示Hoxa10重组载体可显著降低K562细胞对DNR的IC50(P<0.05),对DNR的敏感度能提高约3.58倍。流式细胞术结果显示,该载体下调Hoxa10的表达后,细胞的凋亡率显著增加,可达(16.207±4.891)%(P<0.05),且联合DNR后细胞凋亡率明显提高,凋亡率达(76.887±0.967)%(P<0.05)。结论本实验构建的靶向Hoxa10的真核表达载体对K562细胞中Hoxa10的表达有明显抑制作用,并能明显增强其对DNR的化疗敏感度。
- 范文文贾秀红李建厂
- 关键词：HOXA10SHRNA柔红霉素K562
- HOXA10基因在儿童急性白血病中的表达及意义
- 2012年
- 目的探讨急性白血病患儿同源盒(HOX)A10基因的表达及其临床意义。方法选择50例初治急性白血病患儿,其中急性髓系白血病(AML)25例、急性淋巴细胞白血病(ALL)25例,以及13例对照儿童,分离其骨髓单个核细胞,运用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测骨髓单个核细胞HOXA10 mRNA;检测急性白血病患儿外周血白细胞计数(WBC),分析不同类型急性白血病患儿HOXA10基因表达之间的关系。结果对照儿童HOXA10基因的阳性表达率为23.08%,ALL患儿为40%,AML患儿为100%;平均表达灰度比值(ODR)分别为对照儿童0.022±0.001,AML患儿0.373±0.113,ALL患儿0.151±0.006,三组间阳性表达率及表达水平差异均有统计学意义(P<0.01),其中尤以AML患儿最高。HOXA10基因在各型AML中均有表达,其表达水平依次为M1和(或)M2型、M3型、M4和(或)M5型,差异有统计学意义(P<0.01)。WBC≥30×109/L的急性白血病患儿的HOXA10基因阳性表达率显著增高;高危组急性白血病患儿的HOXA10基因的阳性表达率也明显高于中危组和低危组。结论 HOXA10基因的高表达与儿童急性白血病,尤其是与AML明显相关,并且随着AML白血病细胞分化成熟表达逐渐下降;HOXA10基因的阳性表达率与儿童急性白血病危险程度呈正相关,有望成为儿童急性白血病诊断、治疗及判断预后的一个靶点。
- 范文文贾秀红李建厂李仲霞唐慎华
- 关键词：HOXA10基因白血病儿童
- HOXA10基因沉默对白血病细胞化疗药物敏感性影响的观察被引量：1
- 2013年
- 目的:探讨沉默同源盒基因A10(HOXA10)对白血病U937细胞化疗药物敏感性的影响。方法:选择白血病细胞株U937为实验细胞,应用慢病毒载体介导短发卡RNA(shRNA)靶向沉默HOXA10基因(KD组)、并设阴性对照(NC)组、空白对照(CON)组。用流式细胞仪测定慢病毒的感染效率,RT-PCR和蛋白质印迹法检测shRNA干扰后的HOXA10基因mRNA和蛋白表达水平;在阿糖胞苷和柔红霉素作用实验细胞后,用四甲基噻唑氮蓝(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)法和流式细胞仪分别检测实验细胞的增殖和凋亡水平。结果:慢病毒对U937细胞的感染率为90%;KD组HOXA10mRNA表达水平为0.047 3±0.016 8,低于NC组0.225 2±0.059 5,P=0.004,同时低于CON组0.261 3±0.054 9,P=0.002;KD组HOXA10蛋白表达水平为0.001 5±0.000 8,低于NC组0.013 4±0.005 9,P=0.001,同时低于CON组0.014 5±0.001 6,P=0.001。KD组U937细胞的阿糖胞苷半数抑制浓度(IC50)为(12.80±4.32)μg/mL,显著低于NC组(116.65±16.66)μg/mL,P<0.001,同时低于CON组(100.14±15.45)μg/mL,P<0.001;KD组U937细胞柔红霉素IC50为(75.33±20.40)ng/mL,低于NC组(245.00±46.13)ng/mL,P=0.001,同时低于CON组(267.67±32.65)ng/mL,P<0.001。KD组阿糖胞苷诱导的细胞凋亡率为(71.37±3.24)%,高于NC组(45.27±1.88)%,P<0.001,同时高于CON组(39.39±4.46)%,P<0.001;KD组柔红霉素诱导的细胞凋亡率为(59.72±3.07)%,高于NC组(34.96±5.89)%,P=0.004,同时高于CON组(35.05±9.23)%,P=0.004。NC和CON组之间IC50和细胞凋亡率差异无统计学意义。结论:沉默HOXA10基因可增加U937细胞对化疗药物的敏感性。
- 贾秀红张艳君李建厂
- 关键词：白血病阿糖胞苷柔红霉素
