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广西壮族自治区卫生厅重点科研课题(200970)
广西壮族自治区卫生厅重点科研课题(200970)
- 作品数：8 被引量：28H指数：2
- 相关作者：李力于继云王鹤更多>>
- 相关机构：广西医科大学附属肿瘤医院军事医学科学院更多>>
- 发文基金：广西壮族自治区卫生厅重点科研课题广西卫生厅科研项目国家自然科学基金更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学更多>>
- HPV58型复合DNA疫苗抗肿瘤免疫效果的初步观察
- 2013年
- 目的 初步观察PVAX1-HPV58mE6E7FcGB复合DNA疫苗的抗肿瘤免疫效果.方法 在检测该复合疫苗的免疫效果前,自行构建了稳定表达HPV58E6E7融合基因的B16-HPV58E6E7成瘤细胞系,表达并纯化了HPV58E6E7-GST融合蛋白作为抗原.将该疫苗免疫C57BL/6小鼠（免疫组）后,通过抗肿瘤移植保护实验和肿瘤生长抑制实验观察该疫苗对小鼠负荷的B16-HPV58E6E7移植瘤的防治效果；通过特异性抗体检测、酶联免疫斑点检测、特异性杀伤实验观察该疫苗在被免疫小鼠体内诱发的体液和细胞免疫反应.以单纯抗原PVAX1-HPV58mE6E7 Fc免疫小鼠作为单纯抗原组.结果 抗肿瘤移植保护实验显示,经PVAX1-HPV58mE6E7FcGB疫苗免疫的小鼠成瘤率仅为9/15,但成瘤时间最长[为（13.6±1.7）d],且肿瘤生长最慢.在肿瘤生长抑制实验中,疫苗组小鼠的肿瘤生长抑制率达81.4％.体液免疫检测显示,该疫苗和单纯抗原均能在小鼠体内诱发特异性抗体,最高滴度分别为1∶25 600和1∶12 800,两组比较,差异无统计学意义（P＞0.05）；但在细胞免疫检测中,疫苗组激活的特异性T淋巴细胞数[（219±34）个/4×105个脾淋巴细胞]约为单纯抗原组[（55±25）个/4×105个脾淋巴细胞]的4倍,两组比较,差异有统计学意义（P＜0.05）；且该疫苗诱发的特异性针对B 16-HPV58 E6 E7细胞的杀伤率（最高为43.3％）也明显高于单纯抗原组（杀伤率最高为31.3％）,两组比较,差异有统计学意义（P＜0.05）.结论 PVAX1-HPV58mE6E7FcGB复合DNA疫苗能有效激发特异性的体液和细胞免疫反应,显著抑制B16-HPV58E6E7肿瘤细胞的生长,在细胞免疫上优于单纯抗原,可作为HPV58阳性相关肿瘤及其癌前病变免疫治疗的候选疫苗.
- 王鹤于继云李力
- 关键词：DNA疫苗免疫活性
- 广西宫颈癌患者HPV感染情况的分子流行病学调查被引量：22
- 2012年
- 目的:调查人乳头瘤状病毒(Human papillomavirus,HPV)各亚型在广西壮族自治区宫颈癌患者中的分布情况,为宫颈癌疫苗的研制提供理论依据。方法:应用凯普HPV核酸扩增分型检测试剂盒对515例广西宫颈癌患者的宫颈组织DNA进行21种HPV亚型的检测;并应用实时荧光定量PCR对HPV16、18和58型阳性样本各50、48和41例的病毒负载量进行了绝对定量检测。结果:1)检测的515例样本中473例HPV阳性,HPV总阳性率为91.84%。HPV16的阳性率最高,为81.40%;其次为HPV18(10.15%);第三位是HPV58(8.67%)。排在前五位的HPV亚型依次为HPV 16、18、58、52及31。2)检测样本中HPV16、18和58型的病毒负载量几何均数分别为2.398 5、0.017 3、0.038 1。HPV16分别与HPV18和58型的病毒负载量比较,有显著性差异(P<0.05);HPV18与58型的病毒负载量比较,无显著性差异(P>0.05)。结论:广西宫颈癌患者中有较高的HPV阳性率,其中HPV16型排在首位,HPV18和58虽然分列第二、三位,但阳性率明显低于HPV16。HPV16的病毒负载量远远高于HPV18和58,说明HPV16的高病毒负载量与其高阳性率可能存在一定关系。
- 王鹤于继云李力
- 关键词：人乳头瘤病毒宫颈癌流行病学
- 实时荧光定量PCR检测宫颈癌患者HPV病毒负载量的研究被引量：3
- 2012年
- 目的:检测单一感染人乳头瘤病毒(Human papillomavirus,HPV)16,HPV18,HPV58患者的病毒负载量,为进一步研究高危型HPV的致病机制提供依据。方法:应用实时荧光定量PCR对单一感染HPV16,HPV18,HPV58的样本各50,48,41例的病毒负载量进行定量检测。结果:检测样本中HPV16,HPV18,HPV58的病毒负载量均值分别为(7.89±3.76)×109,(9.55±1.32)×103,(2.38±1.65)×10。HPV16分别与HPV18和HPV58的病毒负载量比较,差异有统计学意义(P<0.05);HPV18与HPV58的病毒负载量比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结论:HPV16的病毒负载量远高于HPV18和HPV58,提示HPV16的高病毒负载量与其高感染率可能存在一定关系。
- 王鹤于继云李力
- 关键词：人乳头瘤病毒宫颈癌
- 人乳头瘤病毒58型E6E7融合基因突变体的转化活性及抗原性被引量：1
- 2013年
- 目的探讨人乳头瘤病毒（HPV）58型E6E7融合基因突变体的转化活性及抗原性。方法分别定点突变HPV58型E6和E7基因中3个氨基酸的密码子，去除突变后的E6和E7基因的终止码并将其基因片段融合，突变修饰后的基因命名为HPV58mE6E7。将重组质粒转染NIH／3T3细胞，plRES—neo-HPV58mE6E7转染组为实验组，plRES-neo-HPV58E6E7转染组为阳性对照组，plRES—neo空载转染组为阴性对照组。流式细胞术、免疫荧光和Westernblot检测转染细胞HPV58mE6E7融合蛋白的表达，软琼脂集落形成和裸鼠皮下成瘤实验检测HPV58mE6E7融合蛋白的转化活性。以HPV58mE6E7融合基因为靶抗原构建DNA疫苗，免疫小鼠后采用酶联免疫吸附试验检测免疫鼠血清中特异性抗体，酶联免疫斑点法检测免疫鼠脾淋巴细胞中可分泌1干扰素的特异性CD8’T细胞数。结果将pGEM—Teasy／HPV58mE6E7和pMD一18T／HPV58E6E7质粒分别测序，HPV58E6E7融合基因与HPV58型E6和E7基因标准序列的同源性达100％，并证实点突变成功。稳定转染HPV58mE6E7和HPV58E6E7的NIH／3T3细胞表达率分别为70．3％和84．1％。实验组和阳性对照组HPV58mE6E7和HPV58E6E7融合蛋白的相对表达水平分别为2．1±1．7和3．8±1．4，阴性对照组HPV58mE6E7和HPV58E6E7融合蛋白呈阴性表达。实验组和阴性对照组未见集落形成；阳性对照组有31个集落形成，其中〉50个细胞的集落10个。实验组和阴性对照组细胞接种裸鼠后，在4周内均未成瘤；而阳性对照组中有6只裸鼠形成肿瘤。以HPV58mE6E7融合基因为靶抗原的DNA疫苗具有良好的抗原性，抗体滴度为25600，特异性免疫斑点数为（218．8±34．4）个，明显高于对照组。结论修饰后的HPV58E6E7基因可融合表达，并在消除其转化活性的同时保留其抗原性，可作为HPV58阳性相关肿瘤治疗性DNA疫苗的靶基因。
- 王鹤于继云李力
- 关键词：基因E6基因E7
- 人乳头瘤病毒58型治疗性复合DNA疫苗载体的构建
- 2012年
- 目的:构建和表达人乳头瘤病毒(Human papilloma virus,HPV)58型相关宫颈癌治疗用PVAX1-HPV58mE6E7Fc-hIL12复合DNA疫苗载体。方法:将HPV58mE6E7融合基因片段插入真核表达载体pCI-Fc-GPI中,构建重组真核表达质粒pCI-sig-HPV58mE6E7-Fc-GPI。再将得到的sig-HPV58mE6E7-Fc-GPI片段插入新型疫苗载体PVAX1-IRES-hIL12中,构建PVAX1-HPV58mE6E7Fc-hIL12复合DNA疫苗载体,流式细胞术、免疫荧光及ELISA分别检测该疫苗载体的表达。结果:经限制性内切酶鉴定及测序分析证实PVAX1-HPV58mE6E7Fc-hIL12复合DNA疫苗载体构建成功。流式细胞术、免疫荧光及ELISA检测表明该疫苗载体中的融合抗原sig-HPV58mE6E7-Fc-GPI及分子佐剂人白介素12(hIL12)能够同时实现真核表达。结论:PVAX1-HPV58mE6E7Fc-hIL12复合DNA疫苗载体可作为治疗HPV58相关肿瘤及其癌前病变的候选疫苗载体。
- 王鹤于继云李力
- 关键词：E6基因E7基因真核表达
- 人乳头瘤病毒58型E6E7融合蛋白的原核表达、纯化及鉴定
- 2012年
- 目的:构建pET-42a(+)-HPV58E6E7原核表达质粒,诱导表达人乳头瘤病毒(HPV)58型E6E7融合蛋白。方法:采用PCR方法扩增出HPV58 E6E7融合基因的全长序列,利用DNA重组技术将其定向插入原核表达载体pET-42a(+)中,构建pET-42a(+)-HPV58E6E7原核表达质粒,用限制性内切酶酶切和核酸序列检测对重组质粒进行鉴定;将其转入宿主菌大肠杆菌BL21进行诱导以表达HPV58E6E7融合蛋白,并用谷胱甘肽琼脂糖树脂纯化回收HPV58E6E7融合蛋白,用SDS-PAGE及Western印迹鉴定表达蛋白的相对分子质量及抗原性。结果:PCR、限制性内切酶酶切和核酸序列检测证实重组质粒中插入的目的基因大小、方向正确;HPV58E6E7融合蛋白得到高效原核表达及纯化,表达蛋白的分子大小正确,抗原性良好。结论:pET-42a(+)-HPV58E6E7原核表达质粒构建成功,HPV58E6E7融合蛋白得到高效表达及有效纯化,为检测HPV58型治疗性疫苗的免疫效果提供了抗原。
- 王鹤于继云李力
- 关键词：原核表达纯化
- 稳定表达人乳头瘤病毒(HPV)58型E6E7融合基因的B16细胞系的建立被引量：2
- 2011年
- 目的:构建pIRES-neo-HPV58E6E7真核表达载体,稳定转染入小鼠黑色素瘤B16细胞,建立稳定表达HPV58E6E7基因的B16细胞系。方法:采用PCR方法扩增出HPV58E6E7融合基因的全长序列,利用DNA重组技术将其定向插入到真核表达载体pIRES-neo中,并加入酶切位点和6×his标签,构建重组真核表达质粒pIRES-neo-HPV58E6E7。利用阳离子脂质体介导法将其转染入小鼠黑色素瘤B16细胞,经G418加压筛选出稳定转染的阳性克隆。利用Western blot、流式细胞术、免疫荧光等检测方法验证HPV58E6E7融合基因在稳定转染的B16细胞株中的表达。结果:经PCR、限制性内切酶鉴定及测序分析,pIRES-neo-HPV58E6E7重组质粒构建正确,转染B16细胞株后,经过Western blot、流式细胞术和免疫荧光等检测显示B16细胞株能够稳定、高效表达HPV58E6E7融合基因,表明B16-HPV58E6E7稳定转染细胞系构建成功。结论:成功构建了pIRES-neo-HPV58E6E7真核表达载体,建立了可以高效、稳定表达HPV58E6E7融合基因的B16细胞系。该稳定转染细胞系的建立为进一步研究HPV58治疗性基因疫苗的功能提供了良好的靶细胞,为其在肿瘤免疫治疗中的应用奠定了研究基础。
- 王鹤于继云李力
- 关键词：E6E7基因稳定转染小鼠黑色素瘤细胞
- PVAX1-HPV58mE6E7FcGB复合基因疫苗的构建及真核表达
- 2013年
- 为构建和表达人乳头瘤病毒(HPV)58型相关宫颈癌治疗用疫苗,将HPV58mE6E7融合基因片段插入真核表达载体pCI-Fc-GPI中,构建重组真核表达质粒pCI-sig-HPV58mE6E7-Fc-GPI。再将得到的sigHPV58mE6E7-Fc-GPI片段插入新型疫苗载体PVAX1-IRES-GM/B7中,构建PVAX1-HPV58mE6E7FcGB复合基因疫苗。经限制性内切酶鉴定及测序分析证实PVAX1-HPV58mE6E7FcGB复合基因疫苗构建成功。流式细胞术及免疫荧光检测表明该疫苗中的融合抗原sig-HPV58mE6E7-Fc-GPI及分子佐剂GM-CSF/B7.1能够同时实现真核表达。表明PVAX1-HPV58mE6E7FcGB复合基因疫苗可作为治疗HPV58相关肿瘤及其癌前病变的候选疫苗。
- 王鹤于继云李力
- 关键词：E6基因E7基因DNA疫苗真核表达
