【目的】研究防御基因表达模式,筛选抗枯萎病候选基因,进一步阐明抗病机制。【方法】以4号枯萎病生理小种诱导的‘农科1号’香蕉为试材,利用DSN(duplex-specific nuclease)均一化酶结合SMART(switching mechanism at 5′end of the RNA transcript)技术构建香蕉根的均一化全长cDNA文库;并用多重半定量RT-PCR技术研究防御基因的表达模式。【结果】经检测,文库滴度为3.1×106 cfu.mL-1,扩增后库容为2.8×108 cfu.mL-1。随机挑选580个克隆进行测序,去除低质量序列后获得421个unigenes,片段分布在750—3 000 bp,文库重组率为100%,其中,未知功能基因占42%,全长cDNA序列为68%。文库筛选获得7个防御基因,进行不同时间的诱导表达分析,发现苯丙氨酸解氨酶(PAL)、过氧化氢酶(CAT)、β-1,3-葡聚糖酶(PR-2)和胶质乙酰酯酶(PAE)具有较低的本底表达水平;枯萎病菌浸染后,7个防御酶基因表达量增加,过氧化物酶(POX)、几丁质酶(PR-3)、PAE和PAL在第6天达到高峰;虽然7个防御基因在对照植株中的表达模式与诱导后的植株类似,但表达量均显著低于接菌后。【结论】所构建的均一化全长cDNA文库,片段重组性和完整性均达到分离筛选目的基因高质量文库的要求,且证明了7个防御基因不同程度地参与了抗枯萎病反应。
