山东省自然科学基金(Y2007C133)
- 作品数：6 被引量：14H指数：3
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- 慢病毒介导的热休克蛋白70基因对缺血/缺氧诱导嗜铬细胞瘤细胞内钙通道调节机制的研究被引量：5
- 2016年
- 目的：探讨慢病毒介导的热休克蛋白70（HSP70）基因表达对缺血/缺氧嗜铬细胞瘤（PC12）细胞内质网钙稳态的影响及钙通道的调节机制。方法取对数生长期的PC12细胞，分为重组慢病毒感染组〔感染含HSP70及绿色荧光蛋白（GFP）基因的慢病毒〕、慢病毒对照组（感染含GFP但不含HSP70基因的慢病毒）及未感染组。采用四甲基偶氮唑盐比色法（MTT）检测PC12细胞经缺血/缺氧处理4、8、12、24h后的细胞活性，以选取最佳缺血/缺氧时间。采用实时定量反转录-聚合酶链反应（RT-qPCR）检测缺血/缺氧8h时HSP70、肌质/内质网Ca2＋-ATP酶亚型（SERCA2a、SERCA2b）、兰尼碱受体2（RyR2）、三磷酸肌醇受体1（IP3R1）的mRNA转录水平；采用蛋白质免疫印迹试验（WesternBlot）检测缺血/缺氧8h时HSP70、SERCA、IP3R的蛋白表达水平；采用流式细胞仪检测细胞内活性氧（ROS）及游离钙离子（[Ca2＋]i）水平。结果随着缺血/缺氧时间延长，各组细胞活性呈先增强后减弱的趋势，均于8h时达峰值。缺血/缺氧8h时，重组慢病毒感染组细胞活性较未感染组和慢病毒对照组均明显升高〔A值（×10-2）：20.3±2.2比14.1±2.1、15.0±1.6，均P＜0.01〕，HSP70和SERCA的mRNA及蛋白表达均明显上调〔HSP70mRNA（2-ΔΔCt）为0.785±0.018比0.428±0.019、0.423±0.023，HSP70蛋白（灰度值）为2.72±0.20比1.56±0.36、1.63±0.41，SERCA2amRNA（2-ΔΔCt）为0.971±0.037比0.367±0.014、0.347±0.012，SERCA2bmRNA（2-ΔΔCt）为8.869±0.162比3.015±0.091、2.941±0.091，SERCA蛋白（灰度值）为2.84±0.18比1.48±0.26、1.52±0.29〕，IP3R2的mRNA及蛋白表达均明显下调〔IP3R2mRNA（2-ΔΔCt）为0.183±0.020比0.439±0.020、0.433±0.040，IP3R2蛋白（灰度值）为1.15±0.12比1.91±0.20、1.83±0.19〕，差异均有统计学意义（均P＜0.01），而RyR1mRNA表达差异无统计学意义〔2-ΔΔCt（×10-3）：1.97±0.63比2.02±0.22、2.01
- 刘媛关纯郭璐璐李庆淑王芸谢春雨胡丹曲彦
- 关键词：热休克蛋白70PC12细胞
- vAd-HSP70表达对低氧-复氧损伤后神经细胞生长影响
- 2011年
- 目的探讨重组腺病毒介导的热休克蛋白70(HSP70)表达对低氧-复氧损伤后神经细胞生长的影响。方法用携带全长HSP70基因的重组腺病毒vAd-HSP70感染体外原代培养的神经细胞,RT-PCR和Wes-tern blotting方法检测靶细胞中外源性HSP70基因表达。实验分为vAd-HSP70感染组、vAd-GFP感染组和未感染组,3组细胞经低氧-复氧处理后,采用MTT法检测细胞活力,生长曲线检测细胞生长状态,ELISA方法检测细胞培养上清中乳酸脱氢酶(LDH)活力。结果 RT-PCR和Western blotting均可检测到vAd-HSP70感染组细胞中HSP70表达。低氧-复氧处理后,vAd-HSP70感染组细胞的活力明显高于其他两组(F=10.683,P<0.01);细胞生长曲线显示vAd-HSP70感染组细胞生长良好,细胞数明显高于其他两组(F=21.307～24.105,P<0.01);vAd-HSP70感染组细胞培养上清中LDH活力明显低于其他两组(F=7.492,P<0.01),而vAd-GFP感染组和未感染组LDH活力差异无显著性(P>0.05)。结论重组腺病毒介导的HSP70转染可保护神经细胞生长,从而抵抗低氧-复氧损伤。
- 杨芳芳胡丹时飞曲彦
- 关键词：HSP70热休克蛋白质类缺氧腺病毒科
- 不同缺氧时间对神经细胞中外源性HSP70表达的影响被引量：1
- 2009年
- 目的:探讨不同缺氧时间刺激对神经细胞中外源性HSP70基因表达的影响。方法:采用重组腺病毒vAd-HSP70感染体外原代培养的神经细胞,48h后给予感染细胞不同缺氧时间(缺氧0h,0.5h,1h,2h,3h,4h)刺激,再复氧处理后,用RT-PCR和Western blotting检测重组腺病毒介导的HSP70基因在神经元和胶质细胞中的转录表达。结果:重组腺病毒vAd-HSP70感染的神经细胞可检测到外源性HSP70基因的转录表达。经缺氧再复氧处理后,随着缺氧时间延长,HSP70转录水平和蛋白表达都增加,缺氧1h时最高(1.1539±0.0315,0.9699±0.0023),其次是缺氧2h时(1.0398±0.0723,0.9622±0.0026),随后依次降低,缺氧4h组(0.7477±0.0328,0.9335±0.0034)HSP70表达最低,与其他各组比较有统计学意义(P<0.05)。结论:缺氧2h内给予神经细胞再复氧处理外源性HSP70表达水平较高,有利于神经细胞功能的恢复。
- 杨芳芳徐小娜胡丹时飞曲彦
- 关键词：热休克蛋白70神经细胞腺病毒
- 热休克蛋白70对缺血／缺氧嗜铬细胞瘤细胞细胞膜钙通道的调节机制被引量：4
- 2016年
- 目的探讨慢病毒介导的热休克蛋白70（HSP70）表达对缺血／缺氧神经细胞细胞膜钙离子通道的影响及其机制。方法取对数生长期的嗜铬细胞瘤细胞（PC12），以缺氧6h、复氧12h刺激PC12细胞模拟体内神经细胞遭受缺血／再灌注时的病理过程，将细胞分为非感染组，感染含绿色荧光蛋白（GFP）基因但不含HSP70基因的慢病毒对照组（GFP慢病毒对照组），及感染含重组HSP70和GFP基因的慢病毒实验组（HSP重组慢病毒感染组）。采用实时荧光定量反转录-聚合酶链反应（RT—PCR）及蛋白质免疫印迹试验（Western Blot）检测L型钙通道cav1．2、cav1．3亚基，受体门控通道NR1、NR2亚基，及Na^＋／Ca^2＋交换体（NCX）的mRNA和蛋白表达。结果缺氧／复氧处理后，HSP70重组慢病毒感染组细胞cav1．2、NR1、NR2的mRNA及蛋白表达均明显低于GFP慢病毒对照组和非感染组[cav1.2 mRNA（2^-△△Ct）：3．13±0．46比5．12±0．52、5．13±0．66，NR1 mRNA（2^-△△Ct）：1．61±0．44比3．23±0．82、3-31±0．78，NR2 mRNA（2^-△△Ct）：2．09±0．41比3．91±0．64、3．88±0．62；car1.2蛋白（灰度值）：2．82±0．39比3．98±0．23、3．96±0．24，NR1蛋白（灰度值）：1．84±0．35比2．79±0．21、2．86±0．23，NR2蛋白（灰度值）：0．87±0．24比1．57±0．31、1．33±0．44；均P〈0.01]；而GFP慢病毒对照组与非感染组间细胞car1.2、NR1、NR2的mRNA及蛋白表达差异均无统计学意义（均P〉0．01）。非感染组、GFP慢病毒对照组和HSP70重组慢病毒感染组间细胞cav1.3、NCX的mRNA和蛋白表达差异均无统计学意义[cav1.3 mRNA（2^-△△Ct）：4．82±0．32、4．72±0．36、4．82±0．29，NCX mRNA（2^-△△Ct）：3．49±0．78、3．47±0．71、3．56±0．65；cav1.3蛋白（灰度值）：2．63±0．40、2．64±0．39、2．68±0．39，NCX蛋白（灰度值）：3．27±0．48、3．34±0．48、3．31±0．
- 郭璐璐贾超曲彦刘媛宋砚坤王奉涛胡丹
- 关键词：热休克蛋白70慢病毒L型钙通道嗜铬细胞瘤细胞
- 慢病毒介导的热休克蛋白70基因对缺血/缺氧嗜铬细胞瘤细胞钙稳态的影响及机制研究被引量：6
- 2015年
- 目的：探讨慢病毒介导的热休克蛋白70（HSP70）基因表达对缺血/缺氧嗜铬细胞瘤（PC12）细胞钙稳态的影响及机制。方法取对数生长期的PC12细胞，分为重组慢病毒感染组（感染含HSP70及荧光蛋白基因的慢病毒）、慢病毒对照组（感染含荧光蛋白而不含HSP70基因的慢病毒）及未感染组3组。用反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）检测转染细胞HSP70 mRNA表达，蛋白质免疫印迹试验（Western Blot）检测HSP70蛋白表达。PC12细胞缺血/缺氧处理4 h后，用四甲基偶氮唑盐比色法（MTT）检测细胞活性，乳酸脱氢酶（LDH）检测试剂盒测定细胞上清液LDH水平，流式细胞仪检测细胞内游离钙离子（[Ca2＋]i）浓度，ATP酶试剂盒测定Na＋-K＋-ATP酶、 Ca2＋-Mg2＋-ATP酶、总ATP酶活性。结果重组慢病毒感染组PC12细胞HSP70 mRNA和HSP70蛋白表达呈阳性。经缺血/缺氧处理后，与慢病毒对照组和未感染组比较，重组慢病毒感染组细胞活性明显增强（A值：0.575±0.020比0.395±0.014、0.363±0.045，t1＝17.996，t2＝10.600，均P＜0.001），细胞上清液中LDH水平明显降低（U/L：743.46±23.68比935.43±34.77、962.89±26.68，t1＝11.179，t2＝15.044，均P＜0.001），[Ca2＋]i浓度显著降低〔相对荧光强度：（31.60±2.43）%比（41.48±3.33）%、（40.40±3.05）%， t1＝5.853，t2＝5.502，均P＜0.001〕，Na＋-K＋-ATP酶、Ca2＋-Mg2＋-ATP酶、总ATP酶活性显著升高〔Na＋-K＋-ATP酶（μmol·mg-1·h-1）：8.608±0.307比6.728±0.173、6.450±0.091，t1＝9.237、P1＝0.001，t2＝11.675、P2＜0.001；Ca2＋-Mg2＋-ATP酶（μmol·mg-1·h-1）：10.523±0.036比7.910±0.209、8.064±0.195，t1＝9.718、P1＝0.001，t2＝11.535、P2＜0.001；总ATP酶（μmol·mg-1·h-1）：17.041±0.324比14.150±0.182、13.983±0.085，t1＝16.113，t2＝17.602，均P＜0.001〕。慢病毒对照组与未感染组各指标差异均无统计学意义。结论 HSP70能维持缺血/缺氧P
- 胡艳宁李庆淑李智胡丹曲彦
- 关键词：慢病毒热休克蛋白70PC12细胞钙稳态
- 腺病毒介导的热休克蛋白70表达对神经元氧化应激损伤的保护作用被引量：3
- 2010年
- 目的探讨重组腺病毒介导的HSP70表达对过氧化氢(H2O2)诱导的神经元和胶质细胞损伤的保护作用。方法用携带全长HSP70基因的重组腺病毒vAd-HSP70感染体外培养的神经元和胶质细胞,RT-PCR、West-ern blotting检测靶细胞中外源性HSP70的表达。vAd-HSP70感染组、vAd-GFP感染组和未感染组细胞经0.5 mmol/L的H2O2处理后,MTT检测细胞活力,乳酸脱氢酶(LDH)检测试剂盒检测细胞培养上清液中LDH活力,透射电镜观察细胞超微结构变化。结果vAd-HSP70感染组的细胞可检测到外源性HSP70基因表达。H2O2处理后,vAd-HSP70感染组细胞活力较其他组明显增强(P<0.01),vAd-HSP70感染组、vAd-GFP感染组、未感染组细胞培养上清液中LDH活力分别为(976±106)、(1 332±197)、(1 380±121),差异有统计学意义(P<0.01)。电镜结果显示,vAd-HSP70感染组细胞膜较vAd-GFP感染组和未感染组完整清晰,无明显线粒体肿胀及细胞核溶解等不可逆损伤情况。结论腺病毒介导的外源性HSP70表达可保护神经元和胶质细胞抵抗H2O2损伤,具有明确的细胞保护作用。
- 宋晓聪杨芳芳胡丹曲彦
- 关键词：热休克蛋白70腺病毒载体过氧化氢神经元
