国家自然科学基金(30070341)
- 作品数：11 被引量：26H指数：3
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- 相关机构：山东大学宾夕法尼亚州立大学解放军第八十八医院更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金海外青年学者合作研究基金更多>>
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- PCR-ELISA定量检测as-hTERT对HepG2.2.15细胞端粒酶活性的抑制作用被引量：1
- 2002年
- 目的 :采用PCR ELISA方法探讨人类端粒酶催化亚单位 (hTERT)基因关键区段的反义寡核苷酸 (as hTERT)对HepG2 .2 .1 5细胞端粒酶活性的抑制作用。方法 :通过PCR合成as hTERT及无关对照序列 ,体外作用于HBVDNA转染的HepG2 .2 .1 5细胞 ,用PCR ELISA定量检测反义核酸作用后的端粒酶活性 ,MTT法观察as hTERT对细胞生长的抑制作用 ,ELISA法检测as hTERT对HBsAg和HBeAg表达的影响。结果 :as hTERT作用浓度为 1 0 μmol/L时 ,定量检测端粒酶活性 ,A450 nm值为 0 .42 ,低于无关序列与生理盐水对照的A450 nm值 (分别为 1 .46、1 .49) ,as hTERT可抑制细胞生长 ,对HBsAg和HBeAg的最佳抑制率分别为 76%和5 6%。结论 :as hTERT在体外可明显降低HepG2 .2 .1 5细胞的端粒酶活性 ,抑制细胞的生长 ,并可影响HBV抗原表达。
- 刘素侠孙汶生马春红韩丽辉宋静
- 关键词：反义寡核苷酸类
- 反义端粒酶不同给予方式抑制裸鼠人肝癌模型生长的研究被引量：2
- 2003年
- 目的:研究人类端粒逆转录酶(hTERT)基因关键位点的反义寡核苷酸对人肝癌的抑制效应。方法:合成互补于hTERT关键区段的反义寡核苷酸(as-hTERT),以HBVDNA转染的HepG2.2.15细胞接种裸鼠制备人肝癌模型,通过连续用药、一次性用药、混合用药3种不同给予方式观察as-hTERT抑制瘤细胞生长作用。比较不同用药方法对裸鼠成瘤的影响,FCM分析as-hTERT诱导凋亡作用。结果:药物一次性与混合作用裸鼠表现为成瘤潜伏期延长,成瘤率明显低于瘤细胞未用药对照组(P<0.05),瘤体生长缓慢;追加用药后无瘤体生长。瘤内用药9dFCM测细胞凋亡峰为26.95%,G2～M期细胞为1.70%,对照瘤体的各细胞周期分布正常。结论:as-hTERT不同给予方式均可抑制荷瘤裸鼠人肝癌的生长,以追加用药效果最佳,具有潜在的临床应用价值。
- 刘素侠孙汶生韩丽辉马春红曹英林王晓燕
- 关键词：端粒酶反义寡核苷酸类肝癌
- HBV全基因真核表达载体的构建及表达被引量：2
- 2003年
- 目的:为诱导HBV特异性CTL,构建HBV全基因真核表达载体,并对其在细胞中的表达进行了初步研究。方法:以EcoRⅠ酶切pBR322-2HBV和pcDNA3,回收完整的HBV基因片段及线性化的载体pcDNA3,T4DNA连接酶连接HBV和pcDNA3,转化、筛选,酶切鉴定HBV的插入方向。以脂质体将构建的pcDNA3-HBV转染HepG2肝癌细胞,经G418筛选,ELISA检测细胞培养上清中HBsAg、HBeAg的表达,RT-PCR检测转染细胞中PreS1mRNA的表达。结果:经酶切鉴定获得正向插入的pcDNA3-HBV,转染HepG2后,建立了新的肝癌细胞系HepG2.02G,细胞培养上清中可检测到高水平的HBsAg,PreS1mRNA在转染细胞中表达。结论:经体外重组,获得携带全长HBV基因片段的pcDNA3-HBV表达载体,并可在肝癌细胞中稳定表达。
- 高立芬孙汶生马春红刘素侠梁晓红陈有海
- 关键词：肝炎病毒乙型真核细胞
- 针对HBV X基因区三个关键位点的反义寡核苷酸体内抑瘤研究被引量：5
- 2002年
- 目的 :研究HBVX基因区关键区段的反义寡核苷酸 (asON)对人肝癌裸小鼠模型的抑瘤生长及体内抗HBV作用。方法 :PCR法分别合成了互补于HBVX基因的翻译起始区Xp、DR2、ENⅡ区的反义寡核苷酸及无关对照序列 ,进行硫代化修饰 ,以HBVDNA转染的HepG2 .2 .15细胞接种裸小鼠 ,2 4h内同部位一次性用药 10 0 μg ,观察并比较 3种反义硫代寡核苷酸的体内抑瘤作用。ELLSA法检测反义核酸作用裸小鼠血清中HBsAg和HBeAg含量的变化。结果 :3种药物作用裸小鼠组均表现为出瘤潜伏期延长 ,出瘤率明显低于未用药瘤细胞对照组 (P <0 .0 5 ) ,且瘤体生长缓慢。互补于Xp、DR2、ENⅡ区的反义寡核苷酸一次性给药方式对荷瘤鼠HBsAg和HBeAg的表达无明显抑制作用 ;无关序列不影响荷瘤鼠瘤体生长及HBV抗原表达。结论 :针对HBVX基因区关键部位的反义寡核苷酸可抑制荷瘤裸小鼠人肝癌的生长 。
- 曹英林刘素侠张利宁马春红丁培芳孙汶生丁红转
- 关键词：乙型肝炎病毒反义寡核苷酸小鼠肝细胞瘤
- HBV preS2起始区反义核酸对人肝癌细胞在裸鼠体内生长的抑制作用被引量：4
- 2002年
- PCR合成互补于HBVpre S2起始区的反义寡核苷酸 (as preS2 ) ,以HBVDNA转染的HepG2 2 15细胞接种裸鼠制备人肝癌模型 ,通过连续用药、一次性用药、混合用药等三种途径研究其对人肝癌裸鼠模型的抑瘤生长及体内抗HBV作用。流式细胞术 (FCM)分析asON诱导瘤细胞凋亡作用 ,ELLSA法检测反义核酸作用裸鼠血清中HBV抗原含量的变化。结果显示 ,一次性与混合用药组裸鼠均表现为成瘤潜伏期延长 ,成瘤率明显低于瘤细胞对照未用药组 (P <0 0 5 ) ,瘤体生长缓慢。裸鼠瘤内连续用药 ,在 48hFCM测凋亡峰值为 39 5 7%,S期细胞降低显著 ,生理盐水与无关序列对照分别为 7 92 %、10 89%,提示as preS2可能诱导S期细胞凋亡。as preS2对荷瘤鼠HBeAg和HB sAg的抑制率分别为 45 %和 6 5 %。提示 ,as preS2可有效抑制体内HBV抗原表达 ,对人肝癌裸鼠在体内的生长有明显的抑制作用。
- 刘素侠孙汶生曹英林马春红丁培芳韩丽辉
- 关键词：反义寡核苷酸ELISA法抗原表达肝癌细胞
- IFN-γ对TRAIL诱导HBV相关性肝癌细胞凋亡的调节作用被引量：6
- 2003年
- 目的 以转染了HBV全基因组、并稳定表达HBV病毒颗粒的HepG2 .2 .15细胞为细胞模型 ,探讨IFN γ对新型凋亡分子TRAIL(TNF相关的诱导凋亡配体 )诱导凋亡的影响 ,并初步探索其发生机制。方法 以流式细胞仪检测IFN γ和TRAIL作用前后 ,HepG2 .2 .15细胞的凋亡率。分别用流式细胞术和半定量RT PCR的方法检测IFN γ作用 0、6、12和 2 4h后 ,细胞表面膜结合型TRAIL和TRAIL受体mRNA的表达。用HBsAg和HBeAgELISA检测试剂盒测定IFN γ作用 0、6、12和 2 4h后 ,HBV病毒颗粒的分泌表达状况。结果 TRAIL单独作用、IFN γ单独作用、TRAIL和IFN γ联合作用后 ,HepG2 .2 .15细胞的凋亡率分别为 9.12 %、5 .84%和 46 .6 8% ,表明IFN γ可以显著上调TRAIL诱导的细胞凋亡。IFN γ作用后 ,细胞表面膜型TRAIL的表达有显著上调 ,而部分与TRAIL诱导凋亡相关的TRAIL受体的表达也有不同程度的上调 ,并且IFN γ可以抑制HepG2 .2 .15细胞HBV病毒颗粒的分泌。结论 转染HBV全基因组的HepG2 .2 .15细胞对TRAIL诱导的凋亡相对耐受 ,而IFN γ却可以逆转这种耐受 ,使其变得对TRAIL诱导的凋亡敏感。其发生机制可能是通过IFN γ上调细胞表面TRAIL及其受体的表达 ,以及抑制HBV病毒颗粒的分泌实现的。
- 韩丽辉孙汶生马春红刘素侠王晓燕于建国张利宁陈有海
- 关键词：IFN-ΓTRAILHBV肝癌细胞凋亡
- hTERT的结构功能特点与应用前景被引量：1
- 2001年
- 端粒酶是维持染色体末端端粒长度和功能稳定的重要物质。在端粒酶的 3个亚单位中 ,其催化亚单位hTERT与端粒酶的活性、肿瘤的发生、发展、诊断以及恶性程度的判断有着最大的相关关系。对hTERT表达的抑制可能会成为治疗肿瘤的一个极有前途的手段。
- 韩丽辉孙汶生马春红
- 关键词：端粒酶催化亚单位肿瘤HTERT功能特点基因治疗
- AFP增强型四元复合体介导N-ras反义RNA抑制HepG2.2.15细胞成瘤性的研究被引量：1
- 2004年
- 目的 观察AFP增强型四元复合体介导的N ras反义RNA转移系统对HBV转基因肝癌细胞系HepG2 .2 .15致瘤性的体内外抑制作用。方法 构建含有N ras反义RNA的AFP增强型四元复合体 ,体外瞬时转染HBV转基因HepG2 .2 .15细胞 ,流式细胞术检测转染前后N ras蛋白表达水平、细胞凋亡率及细胞周期的变化 ,同时建立稳定表达N ras反义RNA的肝癌细胞系HepG2 .2 .15 /as ras,绘制转染前后生长曲线。体内抑瘤试验分别以HepG2 .2 .15或HepG2 .2 .15 /as ras细胞制备荷瘤裸鼠模型 ,比较二者成瘤率。HepG2 .2 .15成瘤组局部瘤内注射N ras反义RNA四元复合体 ,研究其对肿瘤的抑制作用。结果 AFP增强型四元复合体介导N ras反义RNA体外瞬时转染HepG2 .2 .15细胞可显著降低胞内N ras蛋白的表达水平 (P <0 .0 5 ) ,使细胞生长停滞于G0 /G1期 ,且可诱导细胞凋亡。体内抑瘤实验显示 ,HepG2 .2 .15 /as ras细胞注射组成瘤率 ( 4 0 % )显著低于HepG2 .2 .15细胞注射组( 10 0 % )。瘤内注射N ras反义RNA四元复合体可使肿瘤体积明显缩小。结论 AFP增强型四元复合体介导的N ras反义RNA转移系统可降低HBV转基因肝癌细胞HepG2 .2 .15N ras蛋白的表达水平 ,逆转其恶性行为 。
- 梁晓红孙汶生马春红孔建平马亚斌曹英林刘素侠高立芬王晓燕郭春
- 关键词：N-RAS基因反义RNA肿瘤抑制
- 端粒酶反义核酸对BEL-7402肝癌细胞生长和活性的影响被引量：2
- 2002年
- 目的 研究人类端粒酶RNA(hTR )基因的反义寡核苷酸 (AS ODN )对BEL 740 2肝癌细胞生长和活性的影响。方法 将AS ODN作用于BEL 740 2细胞 ,观察细胞生长状况 ,PCR ELISA法检测端粒酶活性 ,流式细胞仪和细胞DNA电泳观察细胞的凋亡情况。结果 AS ODN能抑制BEL 740 2细胞的生长 ,降低其端粒酶活性并诱导细胞凋亡。结论 针对hTR的AS
- 曹英林赵丽孙汶生薛伟华
- 关键词：端粒酶反义核酸肝癌细胞BEL-7402肝癌
- pcDNA3-HBV瞬时转染对巨噬细胞活性的影响被引量：1
- 2005年
- 目的利用HBV全基因真核细胞表达载体pcDNA3-HBV研究HBV感染后对巨噬细胞活性的影响,探讨慢性乙型肝炎患者免疫耐受发生的机制。方法常规制备小鼠腹腔巨噬细胞,分别将pcDNA3-HBV、pcDNA3质粒DNA与绿色荧光蛋白(GFP)的质粒DNApEGFPN1以9∶1混合,利用脂质体转染试剂盒,共转染小鼠腹腔巨噬细胞。转染后72h,半定量逆转录聚合酶链反应(RTPCR)检测HBV前S1、TNFα、白介素(IL)-1βmRNA的表达,流式细胞术测GFP的表达强度、检测核因子κB(NF-κB)蛋白的表达,利用Griess反应检测转染前后培养上清液中NO的水平。结果流式细胞术结果表明,pcDNA3-HBV与pcDNA3转染的巨噬细胞中GFP的表达率无明显差异,pcDNA3-HBV转染的巨噬细胞中检测到前S1mRNA的表达。通过与βactin相比,pcDNA3-HBV转染的巨噬细胞中TNF-α、IL-1βmRNA的表达量显著低于空载体对照组(P<0.01);pcDNA3HBV转染的巨噬细胞表达NFκ-BRelA蛋白的百分数与空载体对照组相当,但平均荧光强度显著低于空载体对照组(pcDNA3HBV转染组为125.05;pcDNA3转染组为203.88);pcDNA3-HBV转染组巨噬细胞产生NO的水平显著低于pcDNA3转染组(分别为15.0±0.6,45.0±1.3,P<0.01)。结论pcDNA3HBV转染后使巨噬细胞NFκB活性显著降低,TNF-α、IL-1βmRNA的表达及NO的产生水平明显下降。
- 高立芬孙汶生马春红张利宁曹英林刘素侠梁晓红刘华
- 关键词：巨噬细胞活性瞬时转染半定量逆转录聚合酶链反应PCDNA3HBV转染真核细胞表达载体
