国家高技术研究发展计划(2005AA246020)
- 作品数：6 被引量：21H指数：3
- 相关作者：张泉朱鸿飞孙怀昌袁维峰于可响更多>>
- 相关机构：扬州大学中国农业科学院北京畜牧兽医研究所中国农业科学院更多>>
- 发文基金：国家高技术研究发展计划国家科技攻关计划更多>>
- 相关领域：生物学农业科学更多>>
- 牛胰腺核糖核酸酶A的基因克隆、表达及初步鉴定被引量：2
- 2006年
- 目的为了避免在制备基因治疗或基因免疫的质粒时使用动物源性的核糖核酸酶A(RNaseA)。方法提取牛胰腺总RNA,利用RT-PCR扩增出牛核糖核酸酶AcDNA,RT-PCR产物克隆到pGEM-T载体测序验证后,将此cDNA亚克隆到大肠杆菌分泌型表达载体pEZZ18中。结果SDS-PAGE电泳显示其转化菌经温度诱导后能表达预计的大小为28kD重组蛋白。用渗透法释放出表达产物,将其加入到经碱裂解粗提的质粒DNA中并孵育0.5h,琼脂糖凝胶结果表明表达产物能很好地去除细菌的RNA并且不降解超螺旋质粒DNA。结论在质粒的纯化过程中,重组牛核糖核酸酶可以替代动物源性的RNaseA。
- 张泉袁燕朱鸿飞张鑫宇孙怀昌
- 关键词：RNASE克隆
- 动物用质粒DNA内毒素去除方法的建立及其质量检验被引量：9
- 2009年
- 用自行改进设计的TritonX-114方法去除动物用重组质粒DNA中的内毒素,鲎试剂检测方法确定每毫克质粒DNA中内毒素的含量为50 EU。将3种不同方法制备的重组质粒pEGFPN1包裹后转染COS-7、MDCK和Marc145细胞,结果表明,经TritonX-114去除内毒素后的质粒DNA(A)与无热源质粒提取试剂盒制备的质粒DNA(B)的转染效率相当,比未经内毒素去除的质粒DNA(C)的转染效率高。将上述3种方法制备的pcDNAlacZ经PEI包裹后尾静脉注射小鼠,注射后每隔2 d扑杀小鼠,取其心、肝、脾、肺和肾组织,定量检测β-半乳糖苷酶的表达和持续时间,结果显示报告基因仅在小鼠的心、脾和肝组织中表达至第8天,A与B的表达水平接近,且明显高于C制备的pcDNALacZ的表达水平,提示经TritonX-114去除内毒素后的质粒DNA可提高转染效率和表达水平。多种动物体内注射重组质粒后,无体温升高等异常临床表征,进一步说明了使用经TritonX-114去除内毒素的质粒DNA具备良好的安全性。
- 张泉袁燕袁维峰孙怀昌朱鸿飞
- 关键词：内毒素转染效率安全性
- 重组大肠杆菌碱裂解方法的改进被引量：3
- 2007年
- 为了降低质粒DNA的生产成本,对经典碱裂解法中的溶液III进行了改进,以表达溶菌酶基因的pcDNKLYZ重组质粒转化的大肠杆菌DH5α为指示菌,用标准碱裂解和改进碱裂解法提取质粒pcDNKLYZ,以提取的质粒产量和质量为指标,判断优化碱性裂解法的性价比,结果显示,用改进后的碱裂解法裂解重组菌,提取的pcDNKLYZ质粒产量和质量等指标与标准方法接近,而成本仅为标准方法的1/4,可用于重组质粒的大规模制备。
- 张泉朱鸿飞于可响薛方明孙怀昌
- 关键词：重组大肠杆菌碱裂解法
- CTAB选择性沉淀和纯化质粒DNA工艺的建立被引量：2
- 2008年
- 通过直接在大肠杆菌碱裂解上清中加入十六烷基三甲基溴化铵（CTAB），优化CTAB与质粒DNA量的比例、质粒DNA选择性释放溶液的选择和TritonX－114的使用，建立了简单、易行的大规模质粒DNA纯化工艺。纯化质粒DNA的质量检测结果显示，CTAB纯化的质粒DNA无菌体RNA污染，菌体基因组DNA、内毒素和蛋白含量分别小于100ng／mg、50EU／mg和10μg／mg质粒DNA，OD260／OD280比值介于1．75－1．85之间，超螺旋质粒DNA的比例大于80％，该工艺纯化的质粒DNA能达到或接近FDA规定的人用质粒DNA的各项指标，整个过程不使用动物源性酶和苯酚、氯仿、无水乙醇等有毒或易燃、易爆试剂，成本低廉，工艺环保。
- 张泉于可响袁维峰薛方明孙怀昌朱鸿飞
- 关键词：十六烷基三甲基溴化铵质粒DNA纯化
- 重组质粒pcDNKCpG在动物体内分布、残留及水平传播检测被引量：1
- 2006年
- 通过肌肉注射的途径将重组质粒pcDNKCpG导入到鸡和猪体内，提取不同时间段的动物组织DNA，特异性的PCR扩增结果提示重组质粒pcDNKCpG主要分布在鸡和猪的血液和注射部位肌肉中，残留时间分别不超过16天和8天；凝胶电泳回收的组织DNA经过酶切、电泳和转膜后的Southem检测表明，重组质粒pcDNKCpG没有整合到鸡和猪的任何组织DNA中去；地高辛标记的CpG核酸探针的Southem检测结果显示重组质粒pcDNKCpG没有整合入宿主的基因组中；特异性的PCR扩增结果证实重组质粒pcDNKCpG没有转移到其他的环境微生物中去。因此，重组质粒pcDNKCpG具有良好的生物安全性。
- 张泉于可响严彩红郭晓宇孙怀昌朱鸿飞
- 关键词：PCR生物安全
- 用于质粒DNA规模化生产的大肠杆菌发酵培养基的筛选被引量：5
- 2007年
- 为降低质粒DNA的生产成本,在标准LB培养基的基础上,利用国产试剂配制成10种大肠杆菌液体培养基,以pEGFPC3、pcDNAlacZ和pcDNKLYZ质粒转化的JM109和DH5α大肠杆菌为指示菌进行小规模发酵培养,定时采样测量OD600值及质粒产量,获得一种高性价比培养基。用该培养基培养重组大肠肝菌,绘制生长曲线,并于其对数生长中期进行42℃诱导。结果表明经42℃诱导后,重组大肠肝菌JM109和DH5α的质粒产量均有提高,重组JM109的产量比重组DH5α约提高20%,为低成本、大规模生产重组质粒提供了良好的技术保障。
- 张泉郭晓宇袁维峰孙怀昌朱鸿飞
- 关键词：质粒DNA细菌培养基
