国家自然科学基金(31201919)
- 作品数：9 被引量：20H指数：3
- 相关作者：何孔旺张雪寒周俊明倪艳秀汪伟更多>>
- 相关机构：江苏省农业科学院吉林农业大学南京农业大学更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金引进国际先进农业科技计划江苏省农业科技自主创新基金更多>>
- 相关领域：农业科学医药卫生更多>>
- 通用引物检测志贺毒素和紧密素多个基因亚型被引量：4
- 2014年
- 目的旨在建立同时检测stx2和intimin两个基因多个变型的双重PCR快速检测技术，更好满足实验室和临床检测的需求。方法以stx2主要的6个亚型和intimin主要的27个基因亚型为靶序列，设计引物，建立双重PCR方法，分析其敏感性、特异性，并检测模拟制备的阳性样品。结果stx2-intimin双重PCR扩增片段分别为388bp和609bp，检测大肠杆菌纯培养物最低限介于10～100cFu／mL，增菌样品最低检测限介于1～10CFU／g，特异性检测intimin和stx2的多个亚型。结论Stx2-Intimin二重PCR技术灵敏、特异、通用和高效。
- 张雪寒汪伟何孔旺倪艳秀温立斌李彬王小敏周俊明
- 关键词：志贺毒素变异型PCR
- 遗传标志性基因Z0372 PCR检测肠出血大肠杆菌O157:H7被引量：3
- 2015年
- 肠出血性大肠杆菌（Enterohaemorrhagic E.coli,EHEC）O157：H7是重要的食源性病原菌,导致严重的人兽共患病。本文旨在建立以Z0372基因为靶基因的PCR检测技术,特异性检测EHEC O157：H7。以Z0372基因为靶序列,设计引物,建立Z0372-PCR,分析敏感性、特异性,并检测模拟阳性污染样品。结果表明,Z0372-PCR对纯培养物检测限103~104CFU/m L,模拟阳性污水样和肉样,增菌后检测限10~102CFU/m L（g）。非大肠杆菌O157和其他肠道病原全部为阴性扩增,只有肠出血性大肠杆菌O157：H7扩增出清晰而特异的条带。模拟阳性样品检测,条带特异,无任何杂带,测序与Gen Bank序列高度同源。因此,Z0372-PCR是特异性检测肠出血性大肠杆菌O157：H7的技术,操作简便,成本低廉,适合实验室肠道内容物、刮取物、污水和食品等的快速检测。
- 张雪寒张碧成栾晓婷汪伟周俊明何孔旺
- 关键词：大肠杆菌O157:H7聚合酶链反应排泄物
- ETEC F4-F5融合基因表达及间接ELISA方法建立被引量：5
- 2016年
- 表达产肠毒素性大肠杆菌(enterotoxigenic Escherichia coli,ETEC)黏附素F4和F5融合蛋白,建立间接ELISA方法,旨在监测猪场ETEC感染以及疫苗免疫情况。根据GenBank中登录F4和F5基因序列,分析保守区,优化密码子,合成F4-F5串联基因,克隆入原核表达载体,表达重组蛋白His-F4-F5。以纯化的His-F4-F5蛋白作为检测抗原,建立检测ETEC抗体的间接EIISA方法。经酶切和DNA序列分析,成功构建重组菌BL21(pCold I-F4-F5),SDS-PAGE和Western blot分析,融合表达F4-F5相对分子质量为29 000,与ETEC高免血清发生特异性反应,条带单一。经优化筛选的间接ELISA最佳反应条件:抗原包被浓度6ng/孔,待检血清稀释比例1∶200,HRP-羊抗猪二抗的工作浓度1∶15 000,5%脱脂奶封闭l h,底物作用时间15min。本研究建立F4-F5间接ELISA方法具有特异性好、敏感性高、重复性好、稳定性强的特点,是猪场ETEC感染和疫苗免疫效果检测的有效工具,进而指导疫苗使用和新型疫苗研发。
- 张强张雪寒何孔旺王春凤
- 关键词：间接酶联免疫吸附试验
- 通用引物检测志贺毒素和紧密素多个基因亚型
- 【目的】志贺毒素和紧密素是大肠杆菌致病群最主要的毒力因子之一,本文旨在是建立能够同时检测志贺毒素和紧密素多个基因变型的二重PCR快速检测技术,更好的适应临床和实验室等的检测需求。【方法】以志贺毒素2(Shiga toxi...
- 张雪寒叶青汪伟倪艳秀温立斌李彬王小敏周俊明何孔旺
- 关键词：志贺毒素变异型PCR
- 文献传递
- H7-HCP-Tir-Intimin高效降低小鼠粪便中大肠杆菌O157:H7排菌被引量：1
- 2014年
- 构建BL21(PcoldⅠ-fliC-hcpA-tir-eae),并评价对小鼠的免疫原性,以期研制更加有效的候选免疫原,最大限度降低E.coli O157:H7对食物、环境和人类的危害。将946、423、309、811bp的fliC,hcpA,tir和eae基因被依次克隆,中间添加8个氨基酸的间隔序列,构建重组菌BL21(PcoldⅠ-fliC-hcpA-tir-eae)。进口白油和ISA50V作为佐剂与重组蛋白乳化,制备2种油乳剂疫苗,分别接种4周龄BALB/c雄鼠,二免21d,口服攻击E.coli O157:H7109 CFU/只,每天采集粪便,检测排菌。结果显示,2种重组疫苗均能够诱导高滴度血清IgG。ISA50V佐剂组抗体产生早于进口白油佐剂组,但进口白油佐剂组抗体滴度一致性更好。所有免疫组小鼠排菌极度降低,第1天排菌低于104 CFU/g,第5天检测不到排菌,整个检测期无反弹,而对照组在整个检测期排菌持续很高(>104 CFU/g)。结果表明,四价重组蛋白H7-HCP-Tir-Intimin能够高效降低口服大肠杆菌O157:H7后的排菌,极显著降低细菌的定植,很大程度减少病原传播,对环境和人类的威胁。
- 张雪寒何孔旺叶青俞正玉倪艳秀温立斌王小敏李彬周俊明汪伟
- 关键词：H7排菌小鼠
- 大肠杆菌O157∶H7独有基因z3276的表达及初步鉴定被引量：2
- 2016年
- 经BLAST分析表明,开放阅读框z3276是大肠杆菌O157∶H7独有的遗传标志性基因,编码氨基酸与大肠杆菌Ⅰ型菌毛有较高的同源性,但z3276基因编码蛋白的生物学特性尚不明确。为了明确z3276基因编码蛋白的抗原性,进一步研究其在大肠杆菌O157∶H7致病过程中的作用。采用PCR方法扩增z3276基因,去除其信号肽序列,克隆到原核表达载体pColdⅠ,转化感受态细胞BL21获得阳性重组菌,IPTG诱导表达重组蛋白,以大肠杆菌O157∶H7全菌抗血清为一抗,Western blot方法检测重组z3276蛋白抗原性。结果显示,成功构建重组菌BL21(pColdⅠ-z3276),并获得高效表达;相对分子质量33 000,占菌体总蛋白30%以上,主要以包涵体形式存在于菌体沉淀中;且与兔源全菌多克隆抗血清发生特异性反应,条带明显。
- 张碧成张雪寒何孔旺范红结
- 关键词：大肠杆菌O157:H7原核表达
- 大肠杆菌O157:H7 CWN11Ⅲ效应因子tccP和tccP2基因序列分析(英文)
- 2013年
- [目的]分析大肠杆菌O157:H7CWN11效应因子tccP和tccP2基因序列。[方法]PCR扩增tccP和tccP2完整基因,以及含有tccP和tccP2侧翼序列的基因,测序分析。[结果]CWN11同时含有tccP和tccP2两个基因,前者含有一个富含脯氨酸的重复序列,而tccP2含有5.5个脯氨酸重复序列,并且第28位密码子无缺失,非假基因。参考菌株SakaitccP含有4.5个脯氨酸重复序列,而tccP2为假基因。[结论]首次报道非典型大肠杆菌O157:H7CWN11同时含有完整的tccP和tccP2,并且tccP可能编码无功能蛋白,而tccP2在细菌定植和激发信号级联中发挥替代功能。
- 张雪寒叶青刘亚栋何孔旺
- 关键词：EHECO157H7荸荠
- 肠出血性大肠杆菌O157∶H7toxB基因的分片段克隆和表达被引量：1
- 2014年
- 根据Gen Bank已有tox B基因全长序列,分别设计6对引物扩增tox B基因,克隆到质粒p GEX-4T-1,构建重组菌BL21(plys)(p GEX-4T-1-tox B),IPTG诱导表达重组蛋白质,用Western blot鉴定重组蛋白质免疫原性。tox B基因片段大小分别为1 531 bp、1 590 bp、1 609 bp、1 603 bp、1 525 bp和1 690 bp,重组蛋白质分子量分别为8.1×104、8.3×104、8.4×104、8.3×104、8.0×104和8.7×104。以兔源EHEC O157∶H7抗血清为一抗,Western blot分析结果显示6个重组蛋白质均具有良好的免疫原性。
- 张雪寒栾晓婷何孔旺倪艳秀周俊明
- 关键词：B基因免疫原性
- 检测产志贺毒素大肠杆菌抗体的间接ELISA试剂盒的研制被引量：2
- 2016年
- 本研究旨在研制一种以紧密素为检测靶标的间接ELISA技术,检测血清中产志贺毒素大肠杆菌（Shiga toxigenic Escherichia coli,STEC）的抗体水平。根据紧密素27个亚型的N端保守序列,体外表达390-543 aa片段制备包被抗原,通过敏感性、特异性、重复性和稳定性实验,建立检测STEC的抗体的间接EIISA方法。经优化筛选的间接ELISA最佳反应条件：抗原包被浓度3 ng/孔,待检血清稀释比例1∶200,HRP-兔抗羊Ig G、HRP-兔抗牛Ig G的工作浓度均为1∶15000,5%脱脂奶封闭l h,底物作用时间10min,用于牛、羊疫苗抗体检测或者STEC大肠杆菌感染的监测。
- 张雪寒张强张碧成汪伟倪艳秀温立斌李彬周俊明何孔旺周萍
- 关键词：致病性大肠杆菌间接ELISA
- 通用引物检测志贺毒素和紧密素多个基因亚型
- 【目的】志贺毒素和紧密素是大肠杆菌致病群最主要的毒力因子之一,本文旨在是建立能够同时检测志贺毒素和紧密素多个基因变型的二重PCR快速检测技术,更好的适应临床和实验室等的检测需求。【方法】以志贺毒素2(Shiga toxi...
- 张雪寒叶青汪伟倪艳秀温立斌李彬王小敏周俊明何孔旺
- 关键词：志贺毒素变异型PCR
