北京市自然科学基金(6112017)
- 作品数：12 被引量：66H指数：4
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- 胡杨果糖-1,6-二磷酸醛羧酶基因PeALD的克隆及耐盐性分析被引量：6
- 2011年
- 胡杨(Populus euphratica Oliv)是优良的抗逆树种,有很强的耐盐碱性。前期胡杨转录组研究结果显示盐胁迫可诱导果糖-1,6-二磷酸醛羧酶基因(PeALD)转录上调,提示该基因可能对胡杨耐盐性方面有某种贡献。为分析PeALD基因在胡杨耐盐性中的作用,本研究以胡杨为材料,利用RT-PCR方法克隆了胡杨果糖-1,6-二磷酸醛羧酶基因的全长cDNA,通过基因转化法尝试在烟草中过量表达该基因,并对转基因株系的耐盐性进行初步分析。研究结果显示,克隆的cDNA编码果糖-1,6-二磷酸醛羧酶,ORF为1177bp,是由247个氨基酸编码的疏水性蛋白,理论等电点为6.84,分子量为26.79kD。PCR与RT-PCR检测结果表明,外源的PeALD基因通过转化已经整合到烟草的染色体中,并在4个株系中得到较强的表达。转化株系表型筛选实验表明,在200mmol/L NaCl的MS培养基中培养15d后,野生型烟草植株无明显高生长,叶片全部黄化并萎缩;而转基因烟草高生长基本没有受到抑制,植株生长良好。说明在烟草中过表达PeALD使转化植株的耐盐性显著提高。光合数据结果显示,ALD基因能够降低盐胁迫对烟草叶片净光合速率的影响,可能是PeALD过表达加速了卡尔文循环的运转,提高了CO2的固定速率,进而促进了光合活性,通过光合作用促进碳的积累,利于呼吸作用和氧化磷酸化产生ATP,为维持跨膜质子浓度梯度提供能量,从而有可能促进质膜上的Na+/H+逆向转运,利于细胞质膜保持拒盐性。这些结果初步验证了PeALD基因的耐盐性功能,为进一步深入研究该基因在耐盐机制中的作用奠定了良好基础。
- 张帆常李伟丁明全侯佩臣沈昕陈少良
- 关键词：转基因烟草抗盐性
- 胡杨果糖-1,6-二磷酸醛缩酶的定位及功能研究被引量：2
- 2013年
- 将从胡杨中克隆的果糖-1,6-二磷酸醛缩酶基因(PeALD)构建到pGEX-4T-1载体上,经IPTG诱导成功获得融合蛋白GST:PeALD,并将蛋白进行纯化,其大小约为52 kD,转化大肠杆菌的耐盐性实验表明,PeALD基因的成功表达有利于提高大肠杆菌菌株的耐盐性。为研究该基因编码蛋白在植物细胞中的定位,将基因的ORF区构建到定位表达载体pMDC85上,通过PEG介导的拟南芥瞬时转化法观察融合蛋白PeALD:GFP在细胞中的定位情况,结果显示该蛋白定位于胞质中,由此说明实验克隆得到的该胡杨果糖-1,6-二磷酸醛缩酶基因编码的是胞质蛋白。烟草种子在盐培养基上的萌发实验结果显示转基因烟草具有更高的耐盐性;烟草水培苗经200 mmol/L NaCl处理一周后,可溶性糖的质谱检测结果显示转基因植株中葡萄糖的含量有很大提高。表明胡杨果糖-1,6-二磷酸醛缩酶通过促进糖酵解和有氧呼吸途径来提高植物对盐胁迫的适应性。
- 胡月张帆申泽丹于瑞赵瑞沈昕陈少良
- 关键词：果糖-1,6-二磷酸醛缩酶原核表达亚细胞定位耐盐性
- 胡杨PeSOS1对拟南芥盐诱导H_2O_2信号途径的调控被引量：1
- 2015年
- 【目的】研究胡杨质膜Na+/H+逆向转运蛋白(SOS1)通过H2O2信号途径对盐胁迫的感知和适应作用。【方法】克隆胡杨质膜SOS1基因(PeSOS1),并将其转化到拟南芥中,比较野生型和转PeSOS1基因拟南芥在100mmol/L NaCl胁迫下的萌发率,根长,干质量,K+、Na+和Ca2+含量,活体植株根尖离子流(K+、Na+和H+)的流动情况,H2O2的产生和抗氧化酶活性的变化以及抑制剂对根尖离子流的影响,分析100mmol/L NaCl胁迫下异源表达PeSOS1基因拟南芥与野生型拟南芥耐盐性的差异。【结果】在NaCl胁迫下,转PeSOS1基因拟南芥株系的萌发率、根长和干质量明显高于野生型拟南芥;转PeSOS1基因拟南芥K+和Ca2+含量也高于野生型拟南芥,而Na+含量较野生型拟南芥低。100mmol/L NaCl处理后,转PeSOS1基因拟南芥中K+和Na+的平衡(K+/Na+值)与NaCl胁迫前相比下降幅度较小。转PeSOS1基因植株在NaCl胁迫下能更快地产生H2O2,并使抗氧化酶保持较高的活性。SOS1抑制剂阿米洛利(Amiloride)对NaCl胁迫下野生型和转基因拟南芥根尖离子流的变化有明显影响,用质膜NADPH氧化酶抑制剂DPI(抑制H2O2的产生)处理后,转PeSOS1基因拟南芥根尖K+内流减弱,Na+外流和H+内流增强,植株维持K+和Na+平衡的能力减弱。【结论】在拟南芥中异源表达PeSOS1基因可促进H2O2快速产生,维持了SOS1mRNA的稳定性,调控了K+和Na+平衡,并激活了抗氧化防御系统,因而显著提高了其耐盐性。
- 王美娟王洋申泽丹马旭君撒刚邓澍荣刘丹丹张玉红沈昕陈少良
- 关键词：盐胁迫转基因拟南芥
- 胡杨PeAPY2基因的克隆及其转化细胞的耐盐性分析被引量：2
- 2013年
- 从胡杨（Populus euphratica Oliv.）抗盐碱能力强于其它种类杨树。本实验室前期对胡杨的研究表明：盐胁迫下,胡杨腺苷三磷酸双磷酸水解酶基因（PeAPY）的转录水平上调,预示该基因可能在胡杨应对盐胁迫中发挥作用。本研究利用RT-PCR方法克隆了胡杨腺苷三磷酸双磷酸水解酶PeAPY2基因,将该基因在烟草BY-2细胞中过表达,分析PeAPY2基因与植物耐盐性的关系。结果证明,PeAPY2编码腺苷三磷酸双磷酸水解酶,其ORF区长为1404bp,编码467个氨基酸。对转PeAPY2基因的烟草BY-2细胞及野生型烟草BY-2细胞进行长期盐处理,结果表明,烟草BY-2细胞过表达PeAPY2基因后提高了耐盐性,但并没有明显改善由甘露醇（200~600mmol/L）引起的渗透胁迫。盐处理（50~150mmol/L,NaCl）2周后,野生型BY-2细胞鲜重和干重都低于转PeAPY2基因的烟草细胞。转基因细胞跟野生型细胞相比,Na＋的上升幅度较小,而K＋的下降幅度也较小。随着盐胁迫时间的延长,转基因细胞膜透性低于野生型细胞,在盐胁迫下细胞活力高于野生型细胞。说明烟草BY-2细胞过表达PeAPY2基因后改善了其对盐的耐受性,这对深入研究PeAPY2基因在胡杨耐盐机制中的作用具有重要的意义。
- 刘丹丹邓澍荣张一南张旋孙健王美娟赵瑞荆艳萍沈昕陈少良
- 关键词：抗盐
- 胡杨PeXTH基因的克隆及其转基因烟草的抗镉性分析被引量：2
- 2014年
- 【目的】克隆胡杨木葡聚糖内转糖苷酶/水解酶基因PeXTH,并研究该基因和植物抗Cd2+性之间的关系。【方法】利用RT-PCR方法从胡杨中克隆一个木葡聚糖内转糖苷酶/水解酶基因PeXTH,将该基因的全长cDNA克隆到植物表达载体pGreen0029上,然后通过农杆菌介导法,将重组表达载体转入烟草,并对转基因烟草的抗Cd2+能力进行初步分析。【结果】PeXTH基因的开放阅读框(ORF)长867bp,含ATG起始密码子和TAG终止密码子,编码由288个氨基酸组成的蛋白;多重氨基酸序列比对结果显示,PeXTH蛋白含有木葡聚糖内转糖苷酶/水解酶(XTHs)的保守催化活性域DEIDFEFLG和N-糖基化位点NLSG;Real-Time PCR检测结果表明,PeXTH基因已经成功在2个转基因株系(L6和L14)中过表达;Cd2+胁迫后,转基因烟草根组织中积累的Cd2+含量显著高于野生型,而叶组织中积累的Cd2+含量明显低于野生型;Cd2+胁迫下,转基因烟草叶片的相对电导率显著低于野生型,但抗氧化酶活性、营养元素含量、叶片净光合速率和蒸腾速率等生理指标都要明显高于野生型。【结论】PeXTH基因的过表达提高了烟草对Cd2+的抗性,为进一步深入研究PeXTH基因在植物抗Cd2+机制中的作用奠定了良好基础。
- 韩彦莎鲁彦君于瑞赵瑞沈昕陈少良
- 关键词：烟草
- 胡杨谷胱甘肽过氧化物酶PeGPX基因的克隆及转化植株耐盐性分析被引量：18
- 2012年
- 胡杨(Populus euphratica Oliv.)具有极强抗盐碱能力。本实验室前期胡杨微阵列芯片数据结果显示:盐胁迫下,胡杨谷胱甘肽过氧化物酶基因(PeGPX)的转录上调,暗示该基因可能对胡杨耐盐性具有一定的作用。为分析 GPX 对植物耐盐性的贡献,本研究以胡杨为材料,利用 RT-PCR 方法克隆了胡杨谷胱甘肽过氧化物酶PeGPX基因,并在烟草中过量表达该基因,以分析谷胱甘肽过氧化物酶活性与植物耐盐性的关系。研究结果显示,实验中克隆的 cDNA (PeGPX)编码谷胱甘肽过氧化物酶,其 ORF 为 693 bp,其蛋白由 231 个氨基酸编码。过量表达 PeGPX 基因的烟草与野生型烟草的耐盐性实验结果显示,野生型烟草植株在加 NaCl(200 mmol/L)的 MS 培养基中生长 15 d 后,无明显的长高,且不长根;而转基因烟草在同样的加盐培养基上,生长基本没有受到抑制,植株生长状态良好,并且能够长根。光合数据显示,在盐胁迫下过量表达 PeGPX 基因烟草的净光合速率受到影响明显小于野生型烟草的净光合速率。酶活数据显示,转基因株系 GPX 酶活与野生型的相比在盐胁迫下活性有非常显著的提高。我们的研究结果说明:过表达 PeGPX 基因使得烟草的耐盐性得到显著提高,这对深入研究PeGPX基因在胡杨耐盐机制中的作用具有重要的意义。高,这对深入研究PeGPX基因在胡杨耐盐机制中的作用具有重要的意义。
- 王菲菲丁明全邓澍荣王美娟孙健侯佩臣马旭君张玉红赵楠沈昕陈少良
- 关键词：谷胱甘肽过氧化物酶转基因烟草抗盐性
- 用GPC-HPLC法测定植物组织中的细胞分裂素被引量：1
- 2012年
- 为了探讨和开发凝胶渗透色谱(GPC)--高压液相色谱(HPLC)法定量测定植物组织中的细胞分裂素,以群众杨叶片和烟草组培苗为试验材料,根据细胞分裂素标准品回收率的测定,得出最佳试验方法:80%甲醇研磨后4℃浸提24h,抽滤,滤液离心,上清液加2滴氨水,40℃浓缩至干,用含3%甲醇的CH2Cl2溶解样品,经0.22μm滤膜过滤后过GPC纯化,最后HPLC外标曲线法定量。用液相--质谱联用仪(LC-MS)对所检测的细胞分裂素定性。测试表明:群众杨叶片中玉米素鲜质量含量439.5018ng/g,烟草叶片中玉米素鲜质量含量为617.9957ng/g。在植物样品中检测到的激动素(鲜质量含量49.4739～124.7124ng/g)应为外源引入。研究结果表明,GPC纯化植物细胞分裂素后用HPLC定量是可行的。
- 李金克邓文红陈少良
- 关键词：细胞分裂素凝胶渗透色谱
- 过表达秋茄C2H2型锌指蛋白基因KcZFP提高烟草耐盐性被引量：6
- 2013年
- 基因转录调节是植物对非生物胁迫适应机制的一个重要方面,转录调节因子在胁迫信号转导途径中调节下游基因的表达,在建立植物对胁迫适应性过程中起到重要作用。锌指蛋白是功能多样的转录调节因子蛋白家族,家族成员在植物响应非生物胁迫方面扮演着重要角色。本研究以秋茄C2H2型锌指蛋白编码基因KcZFP为目的基因,在烟草中过表达KcZFP,分析C2H2型锌指蛋白在植物耐盐性中的作用。研究结果显示:转基因株系中,KcZFP表达量显著提高。过表达KcZFP的烟草植株的耐盐性明显提高,在200mmol/LNaCl处理的条件下,KcZFP过表达烟草中脯氨酸水平远高于野生型植株。对光合作用参数比较分析显示,在KcZFP过表达植株中净光合速率受盐胁迫的影响小于野生型植株,光合系统在一定程度上得到了保护。研究结果说明KcZFP作为转录调节因子参与了植物的渗透调节,对植物的耐盐性具有贡献。
- 于瑞胡月黄旭新申泽丹韩彦莎邓澍荣赵瑞沈昕陈少良
- 关键词：秋茄C2H2型锌指蛋白转基因烟草耐盐性
- 盐胁迫下硫化氢调控杨树根系的离子流被引量：23
- 2013年
- 本文应用非损伤微测技术(non-invasive micro-test technique,NMT)研究了H2S对盐胁迫下耐盐的胡杨和不耐盐的群众杨根部K+、Na+和H+流速的影响。结果表明,两种杨树根系在瞬时(100mmol·L-1NaCl)和短期(24h,50mmol·L-1NaCl)盐胁迫下呈现出K+外流,这种盐诱导的根部K+外流能被50mol·L-1NaHS抑制。此外,H2S能增加短期盐胁迫下Na+的外排,而Na+的外流被Na+/H+逆向转运体抑制剂amiloride或者质膜H+泵抑制剂sodium orthovanadate有效抑制。盐胁迫下,H2S对不耐盐的群众杨根系K+外流的抑制作用和对Na+/H+逆向转运的促进作用高于耐盐的胡杨。据此推测,H2S是通过上调杨树根系胞质膜Na+/H+逆向转运体系(H+泵和Na+/H+逆向转运体),促进Na+和H+逆向跨膜转运,并且,H+泵通过抑制去极化激活的离子通道来限制盐诱导的K+外流。
- 朱会朋孙健赵楠马旭君张玉红沈昕陈少良
- 关键词：群众杨非损伤微测技术
- 秋茄KcTIP1基因克隆及其对植物耐盐性作用的研究被引量：1
- 2013年
- 【目的】从秋茄中克隆液泡膜水通道蛋白KcTIP1基因,并研究其对植物耐盐性的作用机制。【方法】以秋茄幼嫩叶片为材料,通过PCR扩增克隆KcTIP1基因并构建其表达载体,采用根癌农杆菌介导法,用含重组质粒的农杆菌转化烟草植株,通过卡那霉素筛选和转基因烟草基因组PCR、RT-PCR鉴定,获得转基因再生植株;并选取其中2个阳性株系和野生型株系进行盐处理,测定野生型烟草(对照)与盐处理烟草根、茎、叶鲜质量,光合参数,叶片组织Na+、K+浓度以及根尖Na+、K+的流速。【结果】成功克隆得到了KcTIP1基因,对其编码蛋白氨基酸序列进行分析表明,秋茄KcTIP1包含MIP家族的特征序列SGGHVNPAVT和2个保守的NPA(Asn-Pro-Ala)位点。RT-PCR检测结果显示,KcTIP1基因在转基因烟草株系中成功表达。盐胁迫后,转基因烟草植株根、茎、叶鲜质量,叶片净光合速率,蒸腾速率,叶片组织Na+、K+积累和根尖Na+、K+内流幅度均高于野生型烟草。【结论】KcTIP1具有与其他水通道蛋白类似的蛋白结构和酶学功能,KcTIP1基因过表达可以提高转基因烟草的抗盐能力。
- 鲁彦君韩彦莎李妮亚侯佩臣黄旭新邓澍荣赵瑞沈昕陈少良
- 关键词：秋茄烟草耐盐性
