广东省自然科学基金(8451001002000762)
- 作品数：2 被引量：1H指数：1
- 相关作者：许蔓春王鲜艳马恒颢方颖任广立更多>>
- 相关机构：广州军区广州总医院广州医学院第四军医大学唐都医院更多>>
- 发文基金：中国博士后科学基金广东省自然科学基金更多>>
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- 靶向C区的小发卡RNA体外对耐药乙型肝炎病毒的抑制作用
- 2011年
- 目的评价基于载体的靶向乙型肝炎病毒(HBV)C基因的小发卡RNA(shRNA)对耐拉米夫定HBV的抑制作用,探讨新的抗病毒治疗手段。方法从临床耐拉米夫定患儿中提取耐药HBV基因组,经高保真重复延伸及序列拼接后测序,纯化并克隆到pGEM-T Easy TA载体,再经酶切消化,连接入pcDNA3.1载体,构建表达耐药HBV的表达载体pcDNA-HBV-1;根据GenBank收录HepG2细胞系中HBV基因全序列,设计构建针对HBV C基因区的3条siRNA的表达载体pSilencer4.1/HBV-C1,C2,C3。经退火连接入pSilencer-CMV4.1载体。中量超纯提取质粒,定量后与转染试剂siPort XP-1及pcDNA-HBV-1共转染人肝癌细胞系HepG2细胞。分别设立正常HepG2组(未转染组)、载体阴性对照组及共转染组。在共转染后的不同时间点,应用Western blot检测细胞中乙肝病毒表面抗原(HBsAg)蛋白、乙肝病毒e抗原(HBeAg)蛋白的表达;应用实时荧光定量PCR定量检测细胞上清中HBV DNA拷贝的变化。结果构建的耐药HBV表达载体用于转染HepG2细胞,在转染后的第7天至下次传代前该细胞中可检测到稳定表达的HBV DNA,HBsAg、HBeAg可检出。Western blot结果:在转染的第3天载体pSilencer4.1/HBV-C1、pSilencer4.1/HBV-C2、pSilencer4.1/HBV-C3均可抑制HBV的复制与表达,其中pSilencer4.1/HBV-C2抑制效应尤其显著,在转染后第3天对HBsAg、HBeAg的抑制率分别为(83.53±0.48)%、(86.12±0.83)%。定量PCR检测显示特异性siRNA可以显著抑制HBV-DNA,可以使DNA拷贝数降低102个数量级。结论基于载体的特异性siRNA在体外可抑制HepG2细胞中耐药HBV的复制和表达。该特异性siRNA可作为耐拉米夫定HBV的一种有效的基因治疗措施。
- 任广立方颖马恒颢张卫云王鲜艳许蔓春罗爱武赵树进白雪帆
- 关键词：乙型肝炎病毒小干扰RNA基因治疗耐药HEPG2细胞
- 乙型肝炎病毒特异性小干扰RNA对转基因小鼠毒副作用的评价被引量：1
- 2010年
- 目的探讨基于载体的表达性小干扰RNA(siRNA)对乙型肝炎病毒(HBV)转基因小鼠的毒副作用。方法 siRNA表达载体经微静脉注射转染HBV转基因小鼠,设立特异性siRNA组、PBS对照组、阴性质粒对照组及正常Balb/c小鼠对照组。在注射后5 d、12 d、19 d、26 d、33 d、2个月和3个月的不同时间,经其内眦静脉采血检测小鼠ALT水平变化。ELISA方法检测其血清干扰素-α(IFN-α)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平。W estern blot检测其肝脏组织中B细胞淋巴瘤2(Bcl-2)、原癌基因(c-Fos)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)的表达变化。采用TUNEL染色检测细胞凋亡,HE染色进行组织病理学观察。结果基于聚合酶Ⅲ(PolⅢ)的siRNA表达载体与基于聚合酶Ⅱ(PolⅡ)的siRNA表达载体相比,长期作用机体可使转基因小鼠血清ALT水平显著升高(P<0.05);ELISA分析发现IFN-α水平前者似乎高于后者,但差异无统计学意义(P>0.05)。在治疗26 d,直到治疗3个月,特异性siRNA治疗组与PBS对照组相比,TNF-α表达在PolⅢ组表达明显降低(P<0.05);而PolⅡ组TNF-α表达与PBS对照组比较差异无统计学意义。W estern blot结果表明肝组织Bcl-2、c-Fos表达显著增加,而Bax表达明显降低(P<0.05),且该组凋亡分析表明细胞凋亡被明显抑制。组织形态学可见肝细胞出现二倍体,核仁增大,核膜清晰可见。结论基于PolⅢ的siRNA表达载体与PolⅡ的siRNA表达载体相比对肝细胞有一定的毒副作用,凋亡被抑制,细胞增殖失控。过强表达的HBV特异性siRNA可影响机体的生物网络调控,导致增殖与凋亡的失衡。
- 任广立方颖马恒颢张卫云王鲜艳许蔓春彭智勇赵树进
- 关键词：乙型肝炎病毒基因治疗小干扰RNA毒副作用
