河南省基础与前沿技术研究计划项目(082300450110)
- 作品数：9 被引量：19H指数：3
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- 稳定转染DMBT1对胆囊癌细胞株GBC-SD糖链表达的影响及机制被引量：1
- 2011年
- 目的应用已建立的稳定表达候选抑癌基因DMBT1的胆囊癌细胞株GBC-SD，探讨转染前后细胞糖链的变化及其机制。方法针对已成功建立的稳定表达DMBT1的胆囊癌细胞株GBC—SD，细胞分组：GBC—SD／DMBT1，转染DMBT1组；GBC—SD／Vector，转染空载体组；GBC-SD，未处理组；标记2种凝集素探针，即蔓陀萝凝集素（DSA）、刀豆素A（ConA），检测转染前后细胞表达糖链类型变化；采用流式细胞仪检测生物素标记的两种凝集素DSA与ConA在细胞表面的结合；逆转录．聚合酶链反应（RT—PCR）及免疫印迹进一步检测N-乙酰氨基葡萄糖转移酶V（GnT—V）表达。结果凝集素探针实验及生物素标记表明实验组多表达ConA结合型糖链，对照组多表达DSA结合型糖链；RT-PCR及免疫印迹进一步发现实验组表达GnT—V相对灰度值分别为0．32，0．47，显著低于对照组（0．62，0．75），差异均有统计学意义（P〈0．01）。结论DMBT1在体外过表达促进胆囊癌细胞由表达3、4天线、偏2天线转而向2天线型转变．至少部分依赖于GnT—V活性的降低。
- 张玲贺涛黄长山王云检黄涛韩风
- 关键词：胆囊癌糖链
- DMBT1过表达对胆囊癌细胞系GBC-SD粘附增殖的影响
- 2010年
- 目的:观察DMBT1体外过表达对胆囊癌细胞同质、异质粘附能力及细胞增殖能力的影响。方法:以脂质体为介导在体外建立稳定表达DMBT1的胆囊癌细胞系,细胞分组:GBC-SD/DMBT1,转染DMBT1组;GBC-SD/Vector,转染空载体组;GBC-SD,未处理组;平板克隆形成实验检测细胞集落形成能力,细胞聚集实验观察细胞同质粘附能力,层粘蛋白实验及人脐静脉上皮细胞(HUVEC)粘附实验观察细胞异质粘附能力。统计学采用配对或独立样本t检验,P<0.05有统计学意义。结果:平板克隆实验发现GBC-SD/DMBT1组克隆形成数20±3,GBC-SD/Vector组46±8,差异有统计学意义(P<0.01);细胞聚集实验表明GBC-SD/DMBT1聚集指数在振摇时间40、60min时分别为0.471±0.041、0.610±0.050,显著高于GBC-SD/Vector(40、60min时分别为0.250±0.024、0.312±0.026),差异有统计学意义(P<0.01);层粘蛋白Ln粘附实验表明GBC-SD/DMBT1在培养60、90min时残留细胞吸光度分别为0.157±0.008及0.139±0.010显著低于GBC-SD/Vector(60、90min时分别为0.347±0.026、0.476±0.023),差异有统计学意义(P<0.01);人脐静脉粘附表明GBC-SD/DMBT1粘附率为0.341±0.042、GBC-SD/vector粘附率为0.694±0.058,差异有统计学意义(P<0.01)。结论:DMBT1在体外过表达抑制胆囊癌细胞的增殖能力,促进胆囊癌细胞与细胞之间的粘附,抑制细胞与基质或异种细胞的粘附。
- 贺涛张玲崔宏王云检黄长山黄涛韩风
- 关键词：胆囊癌粘附增殖
- 甲胎蛋白基因沉默对肝癌细胞迁移黏附能力的影响及其机制被引量：3
- 2018年
- 目的观察甲胎蛋白(AFP)基因沉默对肝癌细胞迁移黏附能力的影响,并探讨其作用机制。方法将肝癌细胞系EGHC-9901分为3组,实验组转染p Silencer3. 0-H1-AFP质粒以沉默AFP基因表达、载体对照组转染空载体、空白对照组未做任何处理,采用Transwell迁移实验检测各组细胞迁移能力,采用细胞聚集实验检测各组细胞同质黏附能力,采用层黏连蛋白黏附实验检测各组细胞异质黏附能力,采用Western blotting法检测各组细胞黏附分子E-钙黏蛋白、CD44V6、整合素β1、整合素α5、α-连环素、β-连环素、CD15。结果实验组、载体对照组、空白对照组每个镜下穿膜细胞数分别为(132±16)个、(335±21)个、(371±32)个,实验组与载体对照组、空白对照组相比,P均<0. 05。振摇时间40 min时,实验组、载体对照组、空白对照组细胞聚集指数(AI)分别为0. 530±0. 020、0. 223±0. 017、0. 240±0. 012,实验组与载体对照组、空白对照组相比,P均<0. 05;振摇时间60 min时,实验组、载体对照组、空白对照组AI分别为0. 632±0. 031、0. 322±0. 021、0. 376±0. 019,实验组与载体对照组、空白对照组相比,P均<0. 05。培养60 min时,实验组、载体对照组、空白对照组OD值分别为0. 157±0. 008、0. 347±0. 026、0. 363±0. 039,实验组与载体对照组、空白对照组相比,P均<0. 05;培养90 min时,实验组、载体对照组、空白对照组OD值分别为0. 139±0. 010、0. 476±0. 023、0. 503±0. 045,实验组与载体对照组、空白对照组相比,P均<0. 05。实验组、载体对照组、空白对照组整合素β1蛋白表达量分别为0. 337、0. 078、0. 051,实验组与载体对照组、空白对照组相比,P均<0. 05;实验组、载体对照组、空白对照组CD15蛋白表达量分别为0. 221、0. 629、0. 631,实验组与载体对照组、空白对照组相比,P均<0. 05。结论 AFP基因沉默可抑制肝癌细胞迁移,促进肝癌细胞的同质黏附能力,抑制肝癌细胞异质�
- 王莉贺涛冯世杰万百顺王效谦张珉张玲韩风
- 关键词：甲胎蛋白肝肿瘤肝癌整合素Β1
- 瞬时转染和稳定转染对RNAi抑制肝癌细胞系EGHC9901 AFP基因表达的影响被引量：2
- 2010年
- 目的构建针对AFP基因的siRNA表达质粒,观察瞬时转染及稳定转染对RNAi抑制AFP基因表达的影响。方法构建针对AFP基因的siRNAs表达质粒,脂质体法分别瞬时转染与稳定转染肝癌细胞系EGHC-9901,western blot及RT-PCR检测靶基因与蛋白抑制效果,灰度分析比较两种转染方式对RNAi抑制AFP基因表达的影响。结果在稳定转染所得的单克隆细胞株中,AFP基因明显被抑制(P<0.05),western blot及RT-PCR灰度分析表明AFP蛋白和mRNA抑制率分别为84.3%与89.7%,而瞬时转染蛋白与mRNA抑制率分别为28.5%与34.2%。结论成功在体外建立稳定表达针对AFP基因的siRNA肝癌细胞系EGHC-9901,稳定转染所得的单克隆细胞株中,AFP蛋白与mRNA显著被抑制并且与mRNA抑制率大大高于瞬时转染。
- 贺涛张玲崔宏王云检黄长山黄涛韩风
- 关键词：甲胎蛋白类
- 肝癌患者中IL-17表达与HBV基因型的相关性研究被引量：4
- 2021年
- 目的探讨肝癌患者中白细胞介素-17(IL-17)表达与乙型肝炎病毒(HBV)基因型的相关性分析。方法选取92例原发性肝癌患者为研究对象纳入肝癌组,选取同期治疗的乙型肝炎患者80例为肝炎组,另选同期健康检查的健康受试者50例为对照组。对三组患者、受试者的血清IL-17水平进行检测对比。并对肝癌组和肝炎组患者的HBV的基因型进行检测,统计对比患者间基因型分布的差异性,并对肝癌患者IL-17水平与HBV基因型相关性进行分析探讨。结果肝癌组患者的IL-17水平高于肝炎组,且高于对照组(P<0.05)。肝癌组患者中随着患者分期的增加,IL-17水平呈现逐渐上升的趋势(P<0.05)。肝癌组患者HBV基因型分布与肝炎组患者HBV基因型分布有显著性差异,肝癌组患者以C基因型为主,肝炎组患者以B基因型为主(P<0.05)。肝癌组患者中,HBV C基因型患者IL-17水平高于B基因型,且高于A基因型、D基因型患者(P<0.05)。结论肝癌患者中IL-17呈现高表达,随肝癌的发生、发展过程呈现规律性升高。并且IL-17的表达与HBV基因型有密切的关联,在C基因型中IL-17呈现高表达。
- 杨娜谢会娟梁文龙
- 关键词：肝癌白细胞介素-17乙型肝炎病毒
- siRNA沉默AFP基因对肝癌细胞系EGHC-9901凋亡的影响被引量：1
- 2011年
- 目的建立稳定表达针对AFP基因siRNA质粒的肝癌细胞模型并探讨对其凋亡的影响。方法构建针对AFP基因的siRNAs表达质粒,脂质体法将该质粒转染肝癌细胞系EGHC-9901,G418筛选4~5周后Western blot及RT-PCR检测靶基因抑制效果,细胞分组：实验组（siRNA-afp）,转染AFP-siRNA质粒组;载体对照组,转染空载体组;空白对照组,未做任何处理组。免疫荧光检测细胞在无血清状态下凋亡情况,Western blot及RT-PCR检测Caspase-3、Caspase-8等凋亡相关蛋白表达。结果在体外成功构建针对AFP的siRNA表达质粒并在体外建立稳定表达该质粒肝癌细胞系EGHC-9901,转染后细胞表达AFP近乎完全抑制;免疫荧光表明促进细胞在无血清状态下的实验组凋亡率为32%±4%,对照组凋亡率为17%±3%,差异有统计学意义（P〈0.05）;RT-PCR及Western blot检测凋亡相关蛋白表明实验组Caspase-3表达较对照组高,差异有统计学意义（P〈0.05）,而Caspase-8、Caspase-9、bcl-2表达无显著差异（P〉0.05）。结论在体外成功建立稳定表达针对AFP基因的siRNA肝癌细胞系,抑制AFP表达可能通过上调Caspase-3表达促进其凋亡。
- 张玲贺涛崔宏王云检黄长山黄涛韩风
- 关键词：甲胎蛋白原发性肝癌凋亡
- siRNA沉默AFP基因对肝癌细胞系EGHC-9901增殖的影响被引量：4
- 2011年
- 目的建立稳定表达AFP-siRNA质粒的肝癌细胞系并探讨对其增殖的影响。方法构建AFP-siRNA,用脂质体法转染肝癌细胞系,G418筛选4～5周,Western blot及RT-PCR检测靶基因表达,分组:实验组、转染AFP-siRNA组;阳性对照组、转染空载体组;空白对照组、未处理组。MTT绘制生长曲线,平板克隆实验观察集落形成,流式细胞仪分析细胞周期。结果成功建立稳定表达AFP-siRNA的肝癌细胞系,实验组表达AFP近乎完全抑制;实验组增殖能力显著低于空载体组;实验组>75μm集落形成数19±2,低于空载体组62±6;实验组G1期细胞数较空载体组提高20%左右。结论成功建立稳定表达AFP-siRNA的肝癌细胞系,抑制AFP表达可使肝癌细胞发生G1期阻滞,明显抑制其增殖及集落形成能力。
- 贺涛崔宏王云检黄长山黄涛韩风张玲
- 关键词：甲胎蛋白原发性肝癌细胞增殖
- 肝癌细胞甲胎蛋白mRNA转染活化的B淋巴细胞诱导细胞毒性T淋巴细胞的抗肿瘤效应被引量：3
- 2013年
- 目的 研究肝癌细胞AFP mRNA转染活化的B淋巴细胞诱导细胞毒性T淋巴细胞的抗肿瘤作用。方法 分离、纯化B淋巴细胞，重组人可溶性CIM0配体（sCD40L）活化人外周血B淋巴细胞；构建PGEM4Z/AFP/A64EGFP质粒，加入T7RNA聚合酶，转录具有PolyA尾端的AFP mRNA；将提取的AFP mRNA电转染 B淋巴细胞作为实验组，选取GAPDH mRNA转染者作为阴性对照组，未转染的B淋巴细胞作为空白对照组。检测各组B淋巴细胞表面抗原提呈细胞标记分子（CD19、CD20、CD21、CD40、CD80、CD83）及主要组织相容性抗原的表达情况；将3组B淋巴细胞与T淋巴细胞分别按1∶40，1∶20，1∶10和1∶5的比例混合培养、诱导、扩增抗原激活T淋巴细胞并测定吸光度值以检测T淋巴细胞增殖能力；以T淋巴细胞作为效应细胞，肝癌细胞系SMMC7721为靶细胞,检测T淋巴细胞对肝癌细胞的杀伤活性。两两比较采用配对t检验，多组比较采用单因素方差分析，方差不齐时采用Tamhane′s T2检验。结果 实验组B淋巴细胞表面标志分子CD19、CD20、CD21、CD40、CD80和CD83的表达水平分别为74±11、78±8、80±10、90±11、82±6、56±5，显著高于阴性对照组的51±5、60±7、53±5、73±8、50±5、49±6，以及空白对照组的46±3、54±5、41±3、56±5、52±6、21±4（t=5.302、4.812、7.627、5.932、9.142、7.813，11.581、7.036、13.592、12.873、9.235、14.619，P〈0.01）。实验组吸光度值显著高于阴性对照组和空白对照组（t=18.203、23.714、15.062、9.417，16.833、19.392、13.871、6.592，P〈0.01）。当T淋巴细胞与肝癌细胞系SMMC7721按照40∶1、20∶1和10∶1的比例混合后，实验组B淋巴细胞诱导产生的T淋巴细胞对肝癌细胞的杀伤率分别为43%±4%、32%±4%和22%±3%，显著高于阴性对照组的15%±5%、7%±3%和6%±2%，以及空白对照组的7%±3%、8%±3%和9%±4%（t=9.141、13.272、11.901，14.372、12.835、9.507，�
- 贺涛张玲黄长山崔宏王云检韩风
- 关键词：甲胎蛋白淋巴细胞
- 人甲胎蛋白mRNA转染CD40配体活化的B细胞效率的优化被引量：1
- 2011年
- 目的观察不同电穿孔条件对人甲胎蛋白（AFP）mRNA转染CIMO活化的B细胞电转染率和存活率的影响。方法分离、纯化B淋巴细胞，重组人可溶性CIM0配体（sCIMOL）活化人外周血B细胞；构建PGEM4Z／AFP／A64．EGFP质粒，加入TTRNA聚合酶，转录具有PolyA尾端的AFPmRNA。选择不同电压（150～350V）、脉冲时间（100—300us）、细胞浓度（1×10^5～5×10^6／ml）、RNA剂量（2—10ug）等，应用电穿孔仪将PGEM4Z／AFP／A64-EGFP质粒导入活化的B细胞，锥虫蓝染色计算细胞存活率，流式细胞仪检测细胞转染效率。结果当B细胞浓度为3×10^5／ml与6ugRNA质粒混合，设定电转染仪电压为250V、脉冲时间为150us时，其电转染率和细胞存活率达到理想水平，转染后24h绿色荧光蛋白（GFP）明显表达，48h后表达最强。结论在适当的电压、脉冲时间下，选择适当的细胞浓度、RNA剂量，在转染后的一定时间范围内，电穿孔法转染活化的B细胞可使目的基因获得较高的转染率，且细胞死亡最少。
- 张玲贺涛黄长山王云检黄涛韩风
- 关键词：甲胎蛋白B细胞电转染
