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教育部“新世纪优秀人才支持计划”(NCET050370)
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相关作者:
郭文毅
李希
吴继红
方媛
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相关机构:
复旦大学上海医学院
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发文基金:
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在体电穿孔辅助基因转染视网膜色素上皮细胞层和光感受器细胞层的实验研究
2010年
目的探讨在体电穿孔辅助基因转染视网膜色素上皮(RPE)细胞层和光感受器(PR)细胞层的可行性。方法147只健康雄性Spragne—Dawley(SD)大鼠根据电穿孑L刺激模式电压值分为5、10、15、20、25、30、35V组,右眼视网膜下腔注射增强型绿色荧光蛋白(EGFP)真核表达质粒pEGFP—N1为实验眼,左眼注射TE Buffer为对照眼。各组根据不同转染方向再分为RPE和PR两个亚组。各组除电压不同外,其余参数均为脉宽99ms,脉冲间期0.5s,连续5个脉冲。将带有负电荷的质粒在电场作用下,拟转染到RPE细胞层,反向置电极,拟转染到PR细胞层。转染后7d取各组视网膜铺片,荧光显微镜下观察EGFP表达强弱、范围及荧光细胞计数分析;采用蛋白质免疫印迹法(Western blot)、实时逆转录聚合酶链反应(RT—PCR)半定量观察EGFP蛋白和mRNA的表达。结果转染后7d,荧光显微镜观察发现,各组RPE亚组对照眼RPE细胞层内均未见特异性荧光表达,实验眼可见绿色荧光表达;各组RPE亚组对照眼视网膜铺片均未见荧光表达,实验眼视网膜铺片均可见转染了EGFP的RPE细胞。Western blot检测显示,随电压增加,EGFP蛋白与β-肌动蛋白条带灰度相对比值呈上升趋势。RTPCR检测显示,各组均产生阳性扩增条带,随电压增高,EGFP mRNA与GADPH mRNA扩增条带灰度相对比值逐渐增高。结论在体电穿孔方法可以有效辅助基因转染大鼠RPE细胞层。
张萌
莫晓芬
郭文毅
吴继红
方媛
张圣海
李希
关键词:
色素上皮
视网膜炎
电穿孔
光感受器
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