国家自然科学基金(31001019)
- 作品数：10 被引量：31H指数：3
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- 安氏隐孢子虫ATP结合盒式转运蛋白1基因的克隆与离子转运被引量：1
- 2016年
- 目的研究安氏隐孢子虫(Cryptosporidium andersoni)ATP结合盒式转运(ATP-binding cassette,ABC)蛋白1基因对细胞内液和细胞外液中K^+、Ca^(2+)、Na^+和Mg^(2+)的转运作用。方法设计特异性引物,从安氏隐孢子虫基因组中PCR扩增CaABC1。构建真核表达质粒pEGFP-C1-CaABC1,采用脂质体转染法将重组质粒转染至小鼠肠上皮细胞(intestinal epithelial cells,IEC)中表达,设空白组(未转染质粒组)、对照组(转染空质粒pEGFP-C1组)和转染组(转染重组质粒pEGFP-C1-CaABC1组)。用溶液离子浓度检测试剂盒检测IEC细胞内液和细胞外液中的K^+、Ca^(2+)、Na^+和Mg^(2+)的浓度。结果扩增出544 bp的CaABC1基因,构建了真核表达质粒载体pEGFP-C1-CaABC1。转染小鼠IEC后,空白组未观察到绿色荧光,对照组和转染组均观察到绿色荧光。在细胞内液中,空白组K^+、Ca^(2+)、Na^+和Mg^(2+)的浓度分别为(5.51±0.51)、(1.98±0.06)、(108.33±1.33)和(0.93±0.03)mmol/L,对照组分别为(6.25±0.70)、(1.90±0.13)、(107.73±1.79)和(0.87±0.05)mmol/L,转染组分别为(14.84±0.90)、(3.40±0.14)、(127.64±1.49)和(1.72±0.20)mmol/L。在细胞外液中,空白组K^+、Ca^(2+)、Na^+和Mg^(2+)的浓度分别为(12.72±0.83)、(3.72±0.03)、(116.83±1.04)和(2.02±0.18)mmol/L,对照组分别为(10.11±0.90)、(3.58±0.06)、(115.89±1.86)和(1.71±0.41)mmol/L,转染组分别为(5.77±0.21)、(1.29±0.18)、(96.21±1.19)和(0.64±0.02)mmol/L。转染组K^+、Ca^(2+)和Mg^(2+)与对照组相比,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论CaABC1蛋白具有协助转运K^+、Ca^(2+)和Mg^(2+)离子的作用。
- 王菊花王攀刘传欢孙秀梅解倩倩薛秀恒
- 关键词：安氏隐孢子虫克隆离子转运
- 合肥地区奶牛源隐孢子虫的分离与鉴定被引量：12
- 2011年
- 目的分离合肥地区奶牛源隐孢子虫,并鉴定其种类。方法采集安徽省合肥市某奶牛场285头成年母牛粪样,采用饱和蔗糖溶液漂浮法和改良抗酸染色法检测牛粪中隐孢子虫卵囊,并分离纯化隐孢子虫阳性粪样中的卵囊,抽提其基因组DNA作为模板,根据隐孢子虫18S rRNA和HSP70基因设计引物,用PCR和巢式PCR方法扩增目的片段,对巢式PCR产物进行克隆、测序,并运用DNAStar软件对序列进行同源性比对,构建系统进化树。结果两种方法检测均为阳性的粪样有5份,感染率为1.8%(5/285)。隐孢子虫卵囊呈椭圆或卵圆形,饱和蔗糖溶液漂浮法分离的隐孢子虫卵囊大小为7.37μm×6.13μm,形状指数(长/宽)为1.20;改良抗酸染色法检获的隐孢子虫卵囊大小为7.58μm×6.20μm,形状指数为1.22。巢式PCR扩增出的18S rRNA和HSP70基因片段分别为250 bp和325 bp。合肥奶牛源隐孢子虫5株分离株18S rRNA基因与安氏隐孢子虫(Cryptosporidium andersoni)DQ989573序列一致性最高,两者在系统进化树上为同一分支。这5株分离株的HSP70基因序列与安氏隐孢子虫AY954892和DQ989576序列一致性最高,且在系统进化树上为同一分支。结论合肥市某奶牛场分离的奶牛源隐孢子虫为安氏隐孢子虫。
- 孙涛刘维王菊花薛秀恒赵长城李培英
- 关键词：安氏隐孢子虫奶牛
- 安氏隐孢子虫ABC2基因的克隆表达与营养物质转运
- 2017年
- 为探究安氏隐孢子虫(Cryptosporidium andersoni)ATP结合盒转运蛋白基因(CaABC2)对营养物质的转运功能,以安氏隐孢子虫基因组作为模板,设计合成CaABC2基因特异性引物,进行PCR扩增,获得CaABC2基因。将克隆的重组质粒CaABC2基因与真核表达质粒pEGFP-C1双酶切后再连接,构建重组真核质粒载体pEGFP-C1-CaABC2;再采用脂质体转染法将重组质粒pEGFP-C1-CaABC2转入小鼠肠上皮细胞(Intestinal epithelial cells,IEC),检测不同组IEC细胞对总胆固醇、还原型谷胱甘肽、葡萄糖和碱性磷酸酶的转运效果。结果表明:扩增出778bp的CaABC2基因,测序分析与预期片段大小一致;重组真核质粒载体pEGFP-C1-CaABC2转染小鼠IEC细胞后,观察到转染后的对照组和转染组IEC有绿色荧光;检测到在细胞内液中,转染组、对照组和空白组的总胆固醇浓度分别为15.99±0.12、11.80±0.35和12.43±0.16 mmol/L;还原型谷胱甘肽浓度分别为15.24±0.44、10.48±0.35和11.04±0.75mmol/L;在细胞外液中,转染组、对照组和空白组的总胆固醇浓度分别10.67±0.17、14.82±0.06和15.84±0.17 mmol/L;还原型谷胱甘肽浓度分别为10.20±0.79、14.60±0.45和15.60±2.50mmol/L。转染组总胆固醇、还原型谷胱甘肽浓度均显著大于空白组和对照组(P<0.05),而在细胞外液中,转染组总胆固醇、还原型谷胱甘肽的浓度均显著小于空白组和对照组(P<0.05)。在细胞内液和外液中,空白组与对照组总胆固醇、还原型谷胱甘肽的浓度之间均未见显著性差异(P>0.05);转染组、对照组和空白组之间的葡萄糖和碱性磷酸酶浓度均没有统计学差异(P>0.05)。CaABC2基因具有协助转运总胆固醇、还原型谷胱甘肽、葡萄糖和碱性磷酸酶的作用,其中转运总胆固醇效果最为明显。
- 王菊花王佳明刘丹丹王攀周杰薛秀恒
- 关键词：安氏隐孢子虫克隆表达
- 牛源隐孢子虫分离株的分子鉴定被引量：1
- 2011年
- 目的对安徽4个牛源隐孢子虫分离株进行鉴定,旨在阐明感染牛隐孢子虫主要虫种。方法采用PCR和Nested-PCR方法分别对4个分离株18S rRNA、HSP70基因进行扩增和测序,所测定的序列经生物信息学分析它们同源性和构建种系发育进化树,以确定各分离株与其他隐孢子虫虫种之间的亲缘关系。结果 (1)它们的18S rRNA基因和HSP70基因与安氏隐孢子虫(C.andersoni)AY954887相似性可达88.3%和98.3%;(2)在遗传进化树方面,它们与AY954892(河南株)亲缘关系接近。结论此次分离的4个牛源隐孢子虫分离株均为安氏隐孢子虫(Cryptosporidium andersoni)。
- 徐文龙李培英徐前明赵长城李锦春王菊花
- 关键词：隐孢子虫奶牛
- 感染隐孢子虫奶牛血液免疫和抗氧化指标的变化被引量：2
- 2012年
- 目的检测感染隐孢子虫奶牛血液免疫和抗氧化体系指标。方法对安徽省某奶牛场325头奶牛粪样采用饱和蔗糖溶液漂浮法检测隐孢子虫感染情况。选择隐孢子虫感染强阳性的7头奶牛作为感染组,同时取7头隐孢子虫粪检阴性奶牛作为对照组,早晨饲喂前从奶牛颈静脉采血,分别测定总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、免疫球蛋白(IgG、IgM和IgA)、中性粒细胞吞噬率、T淋巴细胞转化率、白细胞介素-2(IL-2)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、丙二醛(MDA)、一氧化氮(NO)、丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)、碱性磷酸酶(ALP)、血糖(GLU)、甘油三脂(TG)、Cl-和Ca2+等19项指标。结果 325头奶牛隐孢子虫感染率为31.7%(103/325),根据卵囊的形态和大小,初步鉴定为安氏隐孢子虫(Cryptosporidium andersoni)。与对照组相比,感染组奶牛血清中TP、ALB、IgM、IgA、GSH-Px、ALT、AST、ALP和Cl-含量无显著变化(P>0.05);血清中MDA和NO含量分别升高59.9%和28.1%(P<0.05或0.01);而血清中IgG、SOD、GLU、TG、Ca2+和IL-2含量,以及T淋巴细胞转化率和中性粒细胞吞噬率分别降低了32.9%、11.1%、18.6%、78.9%、14.5%、7.0%、22.0%和20.2%(均P<0.05)。结论感染隐孢子虫奶牛部分免疫指标下降,抗氧化酶活性降低,清除体内自由基的能力减弱。
- 周庆新李锦春徐前明赵长城王希春王菊花刘维李培英
- 关键词：隐孢子虫奶牛免疫指标抗氧化指标
- 鼠隐孢子虫感染犊牛模型的建立及其血液生化指标的变化
- 2014年
- 【目的】研究犊牛感染鼠隐孢子虫后血液生化指标、营养物质代谢相关酶及激素的变化,初步探讨隐孢子虫病的致病机理。【方法】给犊牛腹腔注射地塞米松磷酸钠注射液致其免疫力低下,然后通过经口感染鼠隐孢子虫卵囊构建隐孢子虫感染犊牛动物模型。采集模型组和对照组犊牛隐孢子虫感染前和感染后第14、28天的血液,测定血液中K+、Na+、Cl-、Ca2+、Mg2+、血糖的浓度,以及总蛋白、白蛋白、5-羟色胺、白介素-2的质量浓度和酸性磷酸酶、碱性磷酸酶、谷草转氨酶、谷丙转氨酶的活性。【结果】经口感染鼠隐孢子虫卵囊犊牛粪便中检出了大小、形态与感染卵囊基本相同的隐孢子虫卵囊,表明隐孢子虫感染犊牛动物模型构建成功。隐孢子虫感染前,2组犊牛所有血液生化指标均无显著差异。与对照组相比,在犊牛感染隐孢子虫后14d,血糖浓度、5-羟色胺质量浓度及碱性磷酸酶、谷草转氨酶活性均差异显著(P<0.05);感染隐孢子虫后28d,血糖浓度,白介素-2、5-羟色胺质量浓度及碱性磷酸酶、谷草转氨酶和谷丙转氨酶活性均发生显著性变化(P<0.05)。【结论】成功构建了鼠隐孢子虫感染犊牛动物模型。隐孢子虫感染对犊牛营养物质的吸收利用有一定影响;与营养物质代谢相关的酶与激素对犊牛感染隐孢子虫后营养物质的吸收利用具有一定的调控作用。
- 程帆孙秀梅薛秀恒王菊花李培英周杰刘力源张淑静
- 关键词：隐孢子虫犊牛动物模型血液生化指标
- 鸡胚小肠上皮细胞的分离培养及其热应激效应被引量：3
- 2020年
- 【目的】比较不同消化酶对鸡胚小肠上皮细胞(intestinal epithelial cells,IECs)的分离和培养效果及细胞的热应激能力,为后续研究提供依据。【方法】以15日龄鸡胚为研究对象,分别使用0.5 g/L胰蛋白酶、胶原酶Ⅰ与透明质酸酶联合及中性蛋白酶Ⅱ消化分离其小肠上皮细胞。培养不同时间后,观察IECs的生长状态,测定细胞生长活性;通过免疫荧光染色和免疫组化对所得IECs进行鉴定,确定最佳的消化酶。对优化所得鸡胚IECs于42℃分别进行2,3,4 h热应激处理,以37℃处理的IECs为对照,MTT法和流式细胞测定IECs的相对活力和凋亡率。【结果】细胞形态学观察发现,用胶原酶Ⅰ与透明质酸酶联合消化分离得到了大量小肠绒毛隐窝团块,易贴壁,细胞生长快;用0.5 g/L胰蛋白酶和中性蛋白酶Ⅱ消化分离得到的细胞数量少,贴壁慢。用3种酶消化方法分离的细胞生长曲线均呈“S”形,但用胶原酶Ⅰ与透明质酸酶联合消化分离的细胞生长曲线峰值较高,细胞活性强;联合消化所得IECs特异性标记抗原均为阳性,免疫荧光阳性率达(92.7±7.9)%,细胞膜质呈棕黄色,而对照组细胞膜质无着色。42℃下热应激3 h后细胞活力极显著下降,凋亡率为(35.96±1.57)%,极显著高于对照组的(0.67±0.02)%,可进行后续试验。【结论】采用胶原酶Ⅰ与透明质酸酶联合消化可得到IECs;42℃下处理3 h是构建IECs热应激模型的条件。
- 王菊花张粟子刘丹丹王佳明刘琦董静周杰薛秀恒
- 关键词：鸡胚小肠上皮细胞酶消化法热应激
- 4种小鼠肠上皮细胞分离培养方法的比较被引量：10
- 2013年
- 【目的】比较4种小鼠肠黏膜上皮细胞(Intestinal epithelial cells,IECs)分离方法的分离效果,建立小鼠IECs的有效分离培养方法,获得小鼠IECs原代细胞,为后续研究做准备。【方法】分别采用组织块培养法、嗜热菌蛋白酶消化法、胶原酶Ⅺ和中性蛋白酶Ⅰ联合消化法以及胶原酶Ⅰ和中性蛋白酶Ⅵ联合消化法共4种方法分离小鼠IECs并培养,通过细胞免疫组织化学法和细胞免疫荧光法对分离的IECs进行细胞特异性鉴定,比较4种方法的分离效果。【结果】组织块培养法所获IECs活力好,增殖能力强,但成纤维细胞污染较严重,细胞纯度低;胶原酶Ⅰ和中性蛋白酶Ⅵ分离法获得的IECs数量少且细胞增殖能力弱;嗜热菌蛋白酶消化法及胶原酶Ⅺ与中性蛋白酶Ⅰ联合消化法所获得的小鼠IECs纯度较高,原代培养时增殖能力稍弱于组织块培养法,但传代后增殖能力趋于稳定。通过细胞免疫组织化学法和细胞免疫荧光法对分离的细胞进行鉴定,结果表明,分离的细胞多数为小鼠IECs。【结论】嗜热菌蛋白酶消化法及胶原酶Ⅺ与中性蛋白酶Ⅰ联合消化法均适合肠道上皮细胞的分离和培养。
- 孙秀梅程帆刘维孙涛薛秀恒李培英王菊花
- 关键词：小鼠小肠上皮细胞
- 山羊睾丸支持细胞分离培养及其氧化应激效果研究被引量：4
- 2019年
- 为探究在体外培养过程中山羊睾丸支持细胞(GSCs)存在的氧化应激问题,采用2步酶消化法分离和纯化GSCs,通过形态学观察、MTT法、油红染色和流式细胞鉴定细胞活度和纯度,再用不同浓度的H2O2处理GSCs,研究GSCs的活性、丙二醛(MDA)含量和超氧化物歧化酶(SOD)活性及其DNA指数(DI)的变化。结果表明:GSCs形态为多角形状;在培养至第5天时GSCs活性最强;油红O染色鉴定多数细胞胞质含有红色的脂滴;GATA4阳性细胞率达到88.27±3.29%;添加50μmol/L H2O2组细胞存活率与对照组相比差异不显著(P>0.05),其它各组均显著低于对照组(P<0.05);添加50μmol/L H2O2组MDA含量和SOD的活性均与对照组无显著性差异(P>0.05),而其他各组均与对照组有显著差异(P<0.05);细胞DNA倍体检测发现添加50μmol/L H2O2时,细胞DI为1.08±0.01,未出现异倍体;其他各组细胞DI分别为1.15±0.02、1.20±0.03、1.26±0.03和1.32±0.01,均有异倍体产生。本研究分离纯化了GSCs,并进行培养和鉴定,200μmol/L H2O2处理GSCs后,SOD活性显著降低,MDA含量显著增加,出现明显的异倍体,200μmol/L H2O2是建立GSC氧化应激模型的适宜浓度,以此为后期建立GSC氧化应激模型提供研究基础。
- 王菊花刘丹丹刘琦王佳明董静周杰薛秀恒
- 关键词：山羊支持细胞氧化应激
- 隐孢子虫营养物质转运与代谢研究进展
- 2010年
- 隐孢子虫病是一种呈世界性分布的人兽共患病,系隐孢子虫寄居于人和动物消化道和呼吸道上皮细胞所致。本文主要从隐孢子虫的特殊功能结构、营养物质转运及代谢过程和隐孢子虫对宿主营养物质吸收的影响等进行综述。
- 王菊花薛秀恒李培英
- 关键词：隐孢子虫营养物质转运代谢
