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BMMYA'平板-Fast blue RR顶层琼脂法高效筛选高酶活脂肪酶: 2012年; 摘建立了一种高效筛选高酶活或高产脂肪酶菌株的平板方法。该方法以华根霉(Rhizopus chinensis CCTCCM201021)脂肪酶基因proRCL在毕赤酵母中构建的基因突变文库为筛选对象,利用BMMYA'平板-FastblueRR顶层琼脂法对其中高酶活或高产的脂肪酶突变株进行筛选,将待筛菌株接种至含有2%甲醇的BMMYA'平板上,30℃生长并诱导4～5 d后,平板经脂肪酶致死温度65℃处理1 h,冰浴、室温平衡后,向平板中倾入Fast blue RR顶层琼脂。2 min内周围显示出明显的黑褐色的菌株为高酶活或高产突变株。该方法简便,快速,高效而且准确,筛选阳性率可达到90%。; 王睿喻晓蔚沙冲徐岩; 关键词：FAST BLUE 高温处理

PCR依赖型方法构建高质量酵母基因突变文库被引量：2: 2011年; 针对定向进化中利用亚克隆的方法建立酵母突变文库建库周期长、效率低、库容量低、丰度低等问题,建立了一种基于体内同源重组构建酵母整合型基因突变文库的新方法。步骤为：构建目标基因的重组表达质粒;以此为模版,设计长引物片段,PCR/易错PCR/DNA Shuffling等方法扩增得到两端带有与表达载体40~70 bp同源序列的突变基因;再利用PCR扩增得到表达载体;将扩增得到的目标基因和表达载体以一定的摩尔比混合电转化酵母,目标基因和表达载体在酵母体内同源重组成为完整的表达盒,整合入酵母基因组,获得基因突变文库。对构建的突变文库进行筛选,分别得到了酶活、蛋白表达量及热稳定性提高的突变株。该方法为完全PCR依赖型（PDM）,在体内构建表达盒,效率高,操作方便,将建库周期由2周缩短为3 d,将库容量从传统的103~104提高到105以上,库阳性率达到95%。; 王睿喻晓蔚徐岩郅岩孔宇; 关键词：同源重组毕赤酵母

米根霉(Rhizopus oryzae)脂肪酶基因ProROL在毕赤酵母(Pichia pastoris)中的高效表达: 2013年; 米根霉(Rhizopus oryzae)脂肪酶在食品和油脂加工等方面具有广泛的应用前景。本研究通过PCR技术获得了米根霉脂肪酶前肽基因序列与成熟肽基因序列(ProROL),并将该基因克隆到表达载体pPIC9K上。线性化表达质粒后电转化感受态毕赤酵母菌株(Pichia pastoris)GS115,通过筛选得到了阳性重组菌。摇瓶及7 L罐发酵结果显示,以p-NPP为底物,上清胞外酶活分别为10.6 U/mL和126.8 U/mL。酶学性质研究发现,该酶的最适温度为40℃左右,在低于40℃条件下,保温30 min后,能够保存60%以上的酶活力;其最适pH为8.5左右,在pH 6.0-10.0范围内保持1 h后,均能保留60%以上的酶活力。本研究构建的基因重组菌株将为该酶的工业化生产与应用提供一定的理论基础。; 郭勇亮喻晓蔚徐岩; 关键词：毕赤酵母

D190V点突变提高华根霉Rhizopus chinensis CCTCCM 201021脂肪酶的最适温度和热稳定性被引量：6: 2013年; 【目的】对来源于Rhizopus chinensis CCTCC M201021的脂肪酶进行了D190V定点突变,提高该酶的最适温度和热稳定性。【方法】对毕赤酵母表达的突变酶D190V与野生型酶r27RCL进行酶学性质比较。【结果】D190V的最适温度比r27RCL高5°C,65°C下的半衰期提高了一倍,在其他性质方面,突变酶D190V与r27RCL基本相似。【结论】通过结构分析表明,定点突变D190V提高该酶稳定性的主要原因可能在于提高了突变位点所在的α螺旋的稳定性以及增强了稳定蛋白质结构的氢键作用力。; 吴厚军喻晓蔚沙冲徐岩; 关键词：定点突变最适温度热稳定性

非水相中微生物脂肪酶催化转酯化拆分(R,S)-α-苯乙醇被引量：4: 2011年; 研究了非水有机溶剂体系中脂肪酶不对称转酯化拆分(R,S)-α-苯乙醇反应,比较了15种不同微生物来源的脂肪酶,从中优选出催化活性及对映选择性较高的脂肪酶LipasePS,系统考察了影响该酶催化不对称转酯化反应的关键因素,获得了优化的催化拆分工艺条件.结果表明,脂肪酶LipasePS在非水反应体系中,以正己烷为反应介质,初始水活度为0.75,底物苯乙醇和乙酸乙烯酯浓度分别为0.3和0.6mol/L,加酶量5mg/ml,35°C,200r/min,反应14h后,底物(R,S)-α-苯乙醇的转化率达44.7%,产物(R)-乙酸苯乙酯的光学纯度达98.6%.水活度可影响酶对底物的转化率和对映选择性.; 秦丽娜喻晓蔚徐岩; 关键词：脂肪酶转酯化对映选择性

易错PCR提高华根霉脂肪酶的热稳定性被引量：1: 2013年; 为了提高华根霉Rhizopus chinensis CCTCC M201021脂肪酶的热稳定性,运用定向进化-易错PCR的方法,经两轮易错PCR引入突变,利用fast-blue RR顶层琼脂法对突变文库进行筛选,第一轮易错PCR后筛选到2株突变菌株,第二轮筛选到4株突变株。第二轮最佳突变株Ep2-4,其中3个氨基酸发生了突变:A129S、P168L和V329A。该突变酶ep2-4在60℃下半衰期相对原始酶r27RCL提高5.4倍,T50值提高7.8℃。酶学性质研究表明,突变酶ep2-4在热稳定性提高的基础上,仍保有良好的催化活性。蛋白质三维结构模拟显示,突变A129S可以和Gln133形成氢键,增加了酶表面的亲水性和极性;P168L可以与邻近的Leu164形成疏水键,导致突变酶的热稳定性提高。; 王睿喻晓蔚徐岩; 关键词：定向进化易错PCR 热稳定性毕赤酵母

共表达伴侣蛋白对重组毕赤酵母产米根霉(Rhizopus oryzae)脂肪酶发酵过程的影响被引量：1: 2013年; 【目的】通过共表达伴侣蛋白Ero1p和PDI获得米根霉(Rhizopus oryzae)脂肪酶在毕赤酵母中的高效表达。【方法】利用毕赤酵母基因重组菌高密度发酵的方法,在7 L发酵罐水平上分析共表达伴侣蛋白菌株(BH128)与非共表达伴侣蛋白菌株(H238)对脂肪酶表达的差异。【结果】在相同条件下,BH128发酵产酶能力高于H238,最高酶活可达到2 338.7 U/mL,最大比生长速率达到0.02 h 1,最大产物比形成速率达到944.5 U/(gDCW.h),最大底物比消耗速率也能达到0.15 gmethanol/(gDCW.h),分别是H238的1.7、0.5、4.1和1.3倍,且发酵周期缩短了20 h。【结论】毕赤酵母基因重组菌BH128通过共表达伴侣蛋白Ero1p和PDI,提高了米根霉脂肪酶的产量,而且缩短了发酵周期,为工业化生产奠定了基础。; 卢鑫喻晓蔚沙冲范文来徐岩; 关键词：毕赤酵母高密度发酵

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