江西省自然科学基金(2010GQY0230)
- 作品数：2 被引量：1H指数：1
- 相关作者：刘丹吴晓牧何明曾姝万青更多>>
- 相关机构：南昌大学江西省人民医院赣南医学院第一附属医院更多>>
- 发文基金：中国博士后科学基金江西省自然科学基金国家自然科学基金更多>>
- 相关领域：医药卫生更多>>
- pFLAG-AMPKα2真核表达质粒构建及对心肌缺氧/复氧损伤的作用被引量：1
- 2012年
- 目的:构建大鼠pFLAG-AMPKα2真核表达质粒,分析AMPKα2过表达对心肌细胞缺氧/复氧损伤的影响。方法:提取H9c2心肌样细胞的mRNA,反转录为cDNA。PCR扩增AMPKα2基因的cDNA全长,并将其克隆至pFLAG-CMV-4构建pFLAG-AMPKα2重组质粒。转染pFLAG-AMPKα2至H9c2细胞,West-ern Blot测定AMPKα2的蛋白表达情况,建立缺氧/复氧(A/R)损伤模型,MTT法检测心肌细胞的存活率,生物自动分析仪检测LDH活性,流式细胞术检测各实验组心肌细胞凋亡程度、细胞内ROS的变化,试剂盒检测细胞内抗氧化酶(SOD、GSH-Px)活性。结果:AMPKα2全长基因序列克隆至真核表达载体pFLAG-CMV-4,酶切鉴定片段大小为1700bp,Western blot检测转染pFLAG-AMPKα2后,AMPKα2蛋白在H9c2细胞中高表达。H9c2细胞遭受A/R损伤,心肌细胞存活率下降,LDH活性增加,细胞凋亡加重,ROS生成增加,SOD及GSH-Px的酶活性下降,pFLAG-AMPKα2重组质粒的导入可明显逆转、改善上述各项指标,从而对抗A/R损伤。结论:构建成功的pFlAG-AMPKα2重组质粒能对抗A/R所致的心肌细胞损伤,其机制与改善心肌细胞的氧化应激作用有关。
- 刘丹钟斌万青曾姝吴晓牧何明
- 关键词：缺氧复氧损伤凋亡ROS氧化应激
- AMPKα2基因shRNA重组质粒的构建以及在氯离子介导的大鼠心肌缺氧/复氧损伤中的作用
- 2012年
- 目的:构建AMP活化的蛋白激酶α2亚基(AMPKα2)基因shRNA重组表达质粒,转染H9c2心肌细胞,探讨其在氯离子(Cl-)介导的心肌细胞缺氧/复氧(A/R)损伤中的作用。方法:构建靶向AMPKα2基因的shRNA重组质粒pSuper-AMPKα2 shRNA,转染H9c2细胞;Western blotting法测定AMPKα2的蛋白表达情况。实验分5组,每组重复6次:(1)Control组;(2)A/R组;(3)Cl--free A/R组;(4)pSuper+Cl--free A/R组;(5)pSu-per-AMPKα2 shRNA+Cl--free A/R组。处理结束后,生化自动分析仪测定LDH活性,MTT法测定细胞存活率,流式细胞术检测细胞凋亡和活性氧(ROS)水平,试剂盒检测细胞内超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性。结果:重组表达质粒pSuper-AMPKα2 shRNA经测序证明构建正确;转染心肌细胞后,AMPKα2蛋白表达明显下降;Cl--free A/R组较之A/R组细胞存活率升高,LDH含量下降,细胞凋亡减少,ROS生成减少,SOD和GSH-Px活性增加;转染pSuper-AMPKα2 shRNA质粒后,阻断了Cl--free液的保护作用,且ROS生成增加,SOD和GSH-Px活性也下降。结论:成功构建pSuper-AMPKα2 shRNA重组质粒。AMPKα2基因沉默阻断了Cl--free液对心肌细胞A/R损伤的保护作用。
- 刘丹孙惦许旻周敏吴晓牧何明
- 关键词：复氧损伤氧化性应激
