国家自然科学基金(31160199)
- 作品数：21 被引量：72H指数：5
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- 慢病毒介导骨形态发生蛋白2和血管内皮生长因子165双基因转染骨髓间充质干细胞复合脱钙松质骨治疗兔股骨头坏死被引量：4
- 2019年
- 背景:骨形态发生蛋白2和血管内皮生长因子165均在骨修复过程中扮演着重要角色。利用慢病毒介导这2种基因转染骨髓间充质干细胞复合脱钙松质骨治疗骨损伤具有重要意义。目的:观察慢病毒介导骨形态发生蛋白2和血管内皮生长因子165基因共转染骨髓间充质干细胞复合脱钙松质骨治疗兔股骨头坏死的效果,以此来探讨双基因在未来骨损伤修复过程中的可行性。方法:采用液氮冰冻联合髓芯减压方法制备股骨头坏死模型,将造模成功的实验兔分为3组(n=12):(1)未转染组:植入骨髓间充质干细胞复合脱钙松质骨;(2)单基因转染组:植入骨形态发生蛋白2转染的骨髓间充质干细胞复合脱钙松质骨;(3)双基因转染组:植入骨形态发生蛋白2和血管内皮生长因子165共转染的骨髓间充质干细胞复合脱钙松质骨。术后3,6,9周各组分别处死4只兔子,Westernblot检测股骨头内骨形态发生蛋白2蛋白的表达量;苏木精-伊红染色观察股骨头坏死修复情况。实验方案经桂林医学院动物实验伦理委员会批准。结果与结论:(1)术后3,6,9周各组均有骨形态发生蛋白2阳性表达,单基因转染组、双基因转染组表达量均高于未转染组(P<0.05),且呈递增趋势;术后3周,单基因转染组、双基因转染组骨形态发生蛋白2表达差异无显著性意义(P>0.05);术后第6,9周,双基因转染组骨形态发生蛋白2表达量明显高于单基因转染组(P<0.05);(2)术后9周,双基因转染组新生骨痂可填满股骨头缺损处,未转染组、单基因转染组虽有骨痂形成,但均未填满缺损处;苏木精-伊红染色示未转染组有初级骨小梁形成,但骨细胞坏死较多,骨小梁较少;单基因转染组有大量骨小梁形成,形态较好,仅有部分中断,仍不及正常骨组织;双基因转染组形成大量成熟致密骨小梁,形态与正常骨组织无明显差异;(3)结果表明,慢病毒介导骨形态发生蛋白2和血管内�
- 马跃刚李强陶旋周桢杰朱伦井段江涛
- 关键词：慢病毒骨髓间充质干细胞骨形态发生蛋白2血管内皮生长因子165股骨头坏死
- BMP-2和EGFP重组腺病毒体外转染兔骨髓间充质干细胞的研究被引量：5
- 2014年
- 目的体外培养兔骨髓间充质干细胞(BMSCs)并观察其生物学特性,通过腺病毒介导人骨形态发生蛋白-2(hBMP-2)和EGFP基因转染兔BMSCs后,观察BMP-2和EGFP的表达情况。方法通过密度梯度离心联合贴壁法,分离、培养兔BMSCs,流式细胞仪检测细胞周期和表面标记,体外诱导兔BMSCs向成骨细胞方向分化。转染后,免疫细胞化学染色及蛋白质印迹法(Western blot)检测外源基因的表达。结果兔BMSCs周期约有56.84%处于G1期;CD44表达阳性,CD45表达阴性;经成骨细胞诱导后,Ⅰ型胶原免疫组织化学染色阳性,茜素红染色阳性。转染后,Western blot及免疫细胞化学染色显示细胞内BMP-2有较强的表达。结论成功分离、培养兔BMSCs,并鉴定其具有成骨分化能力;构建的Ad-BMP-2/EGFP可高效转染兔BMSCs,并能稳定表达BMP-2目的基因。
- 陈佳滨李强茹嘉武成聪宁寅宽蔡伟良
- 关键词：骨形态发生蛋白质类腺病毒科充质干细胞转染
- Ad-BMP-2/GFP转染兔骨髓间充质干细胞前后生物学特性的研究被引量：3
- 2014年
- 目的对Ad-BMP-2/GFP转染兔骨髓间充质干细胞(BMSCs)前后的生物学特性进行观察。方法采用密度梯度离心结合贴壁培养法分离获取第10代兔BMSCs,应用流式细胞仪检测细胞表面抗原CD44、CD45、CD29的表达,用携带BMP2和GFP基因的腺病毒转染细胞。分别通过倒置荧光显微镜下观察转染前后细胞形态改变,MTT法分析转染前后细胞增殖的情况,体外Ⅰ型胶原免疫组化染色和钙结节茜素红染色以观察转染前后细胞的成骨分化情况,Western Blot检测转染前后细胞内目的蛋白表达。结果密度梯度离心结合贴壁培养法能获取高纯度第10代兔BMSCs,流式细胞仪检测显示CD44、CD29阳性,CD45阴性。Ad-BMP-2/GFP转染兔BMSCs后在荧光显微镜下观察到绿色荧光,细胞形态向成骨方向分化,在短时间内能促进兔BMSCs的增殖(P<0.05),Ⅰ型胶原免疫组化染色、茜素红染色均呈阳性,Western Blot显示细胞内稳定表达BMP-2目的蛋白。结论 Ad-BMP-2/GFP能成功转染兔骨髓间充质干细胞并能改变其生物学特性。
- 宁寅宽李强蔡伟良武成聪陈佳滨石正松
- 关键词：骨髓间充质干细胞骨形态发生蛋白2腺病毒载体生物学特性BONEPROTEIN
- Ad-hBMP-2/GFP转染兔骨髓间充质干细胞体外骨生成的实验研究被引量：6
- 2015年
- 目的观察Ad-h BMP-2/GFP转染兔骨髓间充质干细胞(BMSCs)体外骨生成中钙化斑形成,并对钙化斑元素构成进行研究。方法用携带h BMP2和GFP基因的腺病毒转染细胞,通过RT-PCR检测转染后BMSCs h BMP-2基因的表达,通过倒置荧光显微镜、钙结节茜素红染色观察转染后细胞形态改变和钙化斑的形成,结合扫描电镜和X线能谱分析(SEM/EDS)技术观测钙化斑表面微观形貌及其元素构成。结果 RT-PCR检测转染后BMSCs表达h BMP-2目的基因,细胞形态向成骨方向分化,钙结节茜素红染色见红色矿化结节,电镜下见钙化灶点状散布于细胞中,细胞重叠生长,分泌基质旺盛。X射线能谱分析显示其表面为钙、磷沉积物,其钙磷比(Ca/P)为1.53。结论 Ad-h BMP-2/GFP能成功转染兔BMSCs,体外诱导BMSCs向成骨方向分化,并具备较好的骨生成能力。
- 宁寅宽李强蔡伟良武成聪陈佳滨石正松
- 关键词：重组腺病毒骨髓间充质干细胞能谱分析
- 慢病毒介导骨形态发生蛋白2和血管内皮生长因子165双基因转染促进骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化被引量：5
- 2018年
- 背景:骨形态发生蛋白2(bone morphogenetic protein 2,BMP-2)和血管内皮生长因子165(vascular endothelial growth factor 165,VEGF-165)均为骨修复过程中必不可少的细胞因子,利用慢病毒转染干细胞研究双因子作用下细胞的生物学改变具有重要意义。目的:探讨慢病毒介导人BMP-2和人VEGF-165双基因转染(2次转染)骨髓间充质干细胞的可行性以及转染后细胞的诱导成骨性能。方法:将骨髓间充质干细胞分为4组:(1)未转染组;(2)空载组:通过2次相同感染复数的空载慢病毒转染细胞;(3)BMP-2组:转染了单个目的基因的细胞(Lv-BMP-2/GFP);(4)BMP-2/VEGF-165组:通过2次转染后携带双目的基因的细胞(Lv-BMP-2/GFP,Lv-VEGH-165/RFP)。转染后不同时间点Western Blot检测目的蛋白表达,MTT法检测各组细胞增殖活性,转染后14 d检测各组细胞碱性磷酸酶活性。结果与结论:(1)空载组、BMP-2组、BMP-2/VEGF-165组在荧光显微镜下均可见相应的绿色及红色荧光蛋白表达;(2)转染后3 d,BMP-2组、BMP-2/VEGF-165组均有相应目的蛋白高表达;转染后7,14,21 d,目的蛋白检测无明显变化(P>0.05);(3)BMP-2/VEGF-165组增殖稍快于BMP-2组(P<0.05),BMP-2组明显快于未转染组、空载组(P<0.05);(4)BMP-2组、BMP-2/VEGF-165组碱性磷酸酶活力明显高于未转染组、空载组;(5)结果表明,慢病毒介导的h BMP-2和h VEGF-165双基因经2次转染成功转入兔骨髓间充质干细胞内,并长期稳定表达,该双因子的表达能通过刺激细胞碱性磷酸酶生成促使细胞更好的向成骨细胞分化。
- 周桢杰李强李诗鹏陶旋马跃刚
- 关键词：骨髓间充质干细胞骨形态发生蛋白2血管内皮生长因子165慢病毒基因转染细胞增殖干细胞慢病毒感染细胞增殖
- 转基因技术及骨髓间充质干细胞在骨缺损修复中的应用与展望被引量：4
- 2013年
- 骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells,BMSCs)是一类存在骨髓内的非造血干细胞,具有较强的增殖功能及多向分化潜能。在一些细胞因子的诱导下可以向成骨系细胞、内皮细胞、成纤维系细胞、成软骨系细胞等方向分化,近年来已成为生物学和医学的研究热点。而转基因技术是一项目前较为热门的生物科技技术。本文简要介绍了不同基因如骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein,BMP)、血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、软骨源性形态发生蛋白1(cartilage-derived morphogenetic protein 1,CDMP-1)、碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)、成骨生长肽(osteogenic growth peptide,OGP)等通过转染后对BMSCs增殖、分化的影响及其在骨缺损修复中的应用。
- 陈佳滨武成聪李强茹嘉宁寅宽蔡伟良
- 关键词：骨缺损增殖分化
- 短期冻存兔骨髓间充质干细胞对其生物特性的影响被引量：6
- 2014年
- 目的探讨短期冻存对兔骨髓间充质干细胞(BMSCs)的增殖、生物特征及成骨能力的影响。方法选取第5代兔BMSCs冻存,30d后复苏、体外培养至第10代作为实验组,设相同代数未冻存的BMSCs为对照组。MTT、细胞周期、细胞表面标志及成骨诱导分化后碱性磷酸酶(ALP)水平、Ⅰ型胶原及钙结节染色作为其增殖、生物特征及成骨能力的评价指标。结果冻存后BMSCs生长潜伏期延长,但生长状态无明显影响;增殖指数和G1期细胞所占比例分别为42.9%±3.4%、57.0%±3.4%,细胞表面标志CD44阳性率为93.62%±1.05%,不表达CD45;成骨诱导第7、14天ALP水平(U/gprot)分别为6.73±1.92、15.99±4.36,第14、21天,Ⅰ型胶原、钙结节茜素红染色阳性;以上结果与对照组比较差异均无统计学意义(P>0.05)。结论短期冻存对兔BMSCs增殖、生物特征及成骨分化潜能无明显影响,冻存后可继续进一步研究。
- 武成聪李强陈佳滨茹嘉蔡伟良宁寅宽
- 关键词：骨髓间充质干细胞冻存生物特性
- hBMP-2基因转染兔骨髓间充质干细胞体内移植后hBMP-2的活性检测被引量：6
- 2015年
- 目的探究人骨形态发生蛋白-2(human bone morphogenetic protein-2,h BMP-2)基因植入兔股骨头坏死模型体内后的活性,为后续实验奠定理论基础。方法 1.采用髓芯减压联合液氮冰冻法制备兔股骨头坏死模型;2.将造模成功的兔子随机分为A、B、C3组(n=12),A组不植入材料,为对照组,B、C组分别植入DBM/BMSCs、h BMP-2/BMSCs/DBM;3.术后第1、第2、第3周各组分别处死4只兔子,分别运用PCR、RTFQ-PCR、Western Blot检测股骨头内h BMP-2基因和蛋白的表达量,评估h BMP-2基因在兔体内的活性。结果植入后,在第1、第2、第3周,PCR结果示:A、B两组h BMP-2基因呈阴性表达,C组h BMP-2基因呈阳性表达;RTFQ-PCR示:C组相对表达量分别为1,0.947±0.025,0.895±0.059,P=0.081;Western blot示:A、B两组h BMP-2蛋白在兔体内呈阴性表达,C组h BMP-2蛋白呈阳性表达;凝胶成像系统分析显示:C组h BMP-2蛋白表达灰度值(目的/内参)分别为:0.530±0.056、0.507±0.066、0.475±0.086,且两两之间比较P>0.05。结论 h BMP-2基因转染BMSCs植入兔股骨头坏死模型体内后能够稳定表达,进而能够持续诱导BMSCs向骨细胞分化,达到修复股骨头坏死的目的。
- 石正松李强宁寅宽蔡伟良李诗鹏
- 关键词：骨组织工程人骨形态发生蛋白2免疫印迹
- 最新进展的转基因技术在骨与软骨缺损修复中的应用被引量：4
- 2013年
- 背景:组织工程技术在骨与软骨的修复方面已经取得巨大进步,其中转基因技术的引入在最近几年也引起人们广泛的关注。目的:总结近5年来转基因技术在骨与软骨缺损修复中的最新研究进展。方法:应用计算机检索CNKI数据库和PubMed数据库2007年1月至2012年3月关于转基因技术治疗骨与软骨缺损方面的文献,中文检索词"基因,治疗,骨,软骨,缺损"。英文检索词"gene,therapy,bone,cartilage,defect",最终纳入22篇符合要求的文献。结果与结论:基因治疗为骨和软骨再生带来了一种新的治疗理念,它可以把具有特异性的目的基因精确转移入靶细胞内,并特异性的表达。目前应用于骨与软骨缺损的基因主要包括骨形态发生蛋白,转化生长因子,碱性成纤维细胞生长因子,胰岛素样生长因子,血管内皮细胞生长因子,Bcl-xl基因等。应用基因治疗可以诱导骨与软骨的形成,为骨与软骨的修复提供了崭新的途径。
- 茹嘉李强
- 关键词：软骨缺损骨形态发生蛋白转化生长因子SOXBCL-XL
- 腺病毒介导BMP-2和EGFP基因转染兔骨髓基质干细胞及种植脱钙骨的体外观察被引量：9
- 2014年
- 目的用腺病毒载体介导人骨形态发生蛋白-2及EGFP基因转染兔骨髓基质干细胞(rBMSC),种植DBM(脱钙骨)支架体外构建组织工程骨。方法兔髓基质干细胞(rBMSC)的分离、培养;流式细胞仪检测细胞表面标记;转染后,荧光显微镜观察细胞最适感染复数(MOI)及蛋白印迹检测外源基因的表达情况;采用Urist提供的方法制备脱钙骨(DBM),用细胞计量法测定BMSCs与DBM复合培养的黏附率。然后将转染后细胞接种到DBM支架上,用荧光显微镜观察细胞是否成功粘附于支架材料上,扫描电镜观察细胞贴附、生长状况。结果 BMSCs细胞表型鉴定:CD44表达阳性,CD45表达阴性;转染后,蛋白印迹试验检测到BMP-2表达增高;骨髓间充质干细胞与脱钙骨基质的平均粘附率为(72.74±1.99)%;扫描电镜见转染细胞生长良好,伸出丝状突起,相互连接。结论成功培养及鉴定兔BMSCs,Ad-BMP-2/EGFP可高效转染兔BMSCs,转染后的细胞种植于DBM支架材料后生长状况良好,组织工程骨构建成功。
- 陈佳滨李强茹嘉武成聪宁寅宽蔡伟良
- 关键词：骨形态发生蛋白骨髓基质干细胞组织工程骨脱钙骨
