西北农林科技大学唐仲英育种基金(A212020912)
- 作品数：12 被引量：30H指数：3
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- 3份小麦品种(系)Gsp-1基因的克隆及序列分析被引量：1
- 2011年
- 根据已报道的谷类作物硬度基因grain softness protein-1（Gsp-1）保守DNA序列设计一对特异性引物,以优质小麦品种（系）中国春、SZ-56及M9876基因组DNA为模板进行基因扩增、克隆和序列测定,获得636 bp的Gsp-1全长特异性片段。序列分析显示其含有495 bp完整的开放阅读框,编码全长为164 aa的蛋白,该蛋白含有Gsp-1典型的19 aa信号肽,10个保守的半胱氨酸以及2个保守的色氨酸。序列比对表明,Gsp-1基因不仅含有Gsp-1 a、Gsp-1 b和Gsp-1 c这3种类型,还含有一种新的类型,将其命名Gsp-1 d。进一步对其结构预测分析发现,Gsp-1蛋白可形成5个链间二硫键,含有4~5个α-螺旋。进化树分析显示Gsp-1基因与硬度主效基因Pina和Pinb有着紧密关系。
- 李志业高翔陈其皎李晓燕董剑赵万春史红飞臧闻
- 关键词：小麦籽粒硬度克隆
- 簇毛麦新型HMW-GS的序列分析及加工品质效应鉴定被引量：2
- 2014年
- 利用设计的HMW-GS特异引物,从簇毛麦TA10220中克隆到6条HMW-GS基因序列(1.0～1.7 kb,GenBank登录号为KF887414～KF887419),比普通小麦HMW-GS基因序列小,其中KF887414～KF887417为能正常表达的基因,KF887418和KF887419是编码区出现终止信号的假基因。综合推导氨基酸的序列分析以及基于编码蛋白全序列、N-端和C-端域的进化树分析,认为KF887414属于y型HMW-GS,KF887415～KF887419的氨基酸序列同时具有x和y型的结构特征。将具有完整编码区的4个基因在宿主菌Escherichia coli Rosetta-gami B(DE3)中经IPTG诱导表达,通过SDS-PAGE分析表达的蛋白质和种子提取的HMW-GS,经Western blot进一步检测表达产物,证明蛋白质表达成功。通过His-Trap HP柱纯化表达蛋白,回收产物经SDS-PAGE分析后,低温冷冻干燥备用。将冷冻干燥的回收产物加入中国春基础面粉中,利用微量掺粉试验通过测定粉质参数来鉴定簇毛麦来源的HMW-GS对面粉品质的影响,结果表明,簇毛麦来源的4个HMW-GS对于面粉加工品质具有显著的正向效应。
- 杨华高翔陈其皎赵万春董剑李晓燕
- 关键词：高分子量谷蛋白亚基原核表达
- 六倍体普通小麦中国春PBF编码基因的克隆及序列分析被引量：2
- 2013年
- [目的]探讨作为模式小麦中国春PBF转录因子编码基因的多样性。[方法]以中国春小麦品种为材料,利用基因特异引物进行PCR扩增,经过胶回收,将目标片段连接至克隆载体上,随机选择阳性质粒测序。序列拼接与比对、信号肽预测、二级结构预测、亚细胞定位及系统演化进行分析分别经由DNAMAN、Signalp、PSIPRED、Nuc_PLoc及MEGA软件进行分析比对。[结果]从六倍体普通小麦中国春基因组中克隆得到25条编码序列,根据序列相似性,将其聚成3种等位类型,亚基2个位点存在SNP,且都导致编码氨基酸残基的改变,并影响到最终编码产物的二级结构。[结论]PBF亚基编码序列在中国春小麦中极端保守,但仍然存在变异。该结果为评价小麦籽粒储藏蛋白亚基的表达效率提供了理论参考。
- 郭丽娜高翔
- 关键词：普通小麦克隆
- 小麦avenin-like的克隆、原核表达与品质效应研究被引量：2
- 2012年
- 【目的】研究普通小麦不同品种的类燕麦贮藏蛋白(avenin-like)基因序列的多样性及其表达产物的加工品质效应。【方法】利用特异性引物对来源于不同地区的12个小麦品种(系)进行PCR扩增、克隆、测序及序列分析;构建JN542444原核表达载体后转入表达菌株Escherichia coli Rosetta gami B(DE3),IPTG诱导融合蛋白表达,并通过His-Trap HP柱纯化蛋白后进行微量掺粉试验。【结果】克隆获得22条avenin-like新基因序列(GenBank登录号JN542443—JN542464),长度均为855 bp,且均具有可编码284个氨基酸残基的完整的开放阅读框,无内含子;半胱氨酸数目及位置相对保守,除JN542452含有17个Cys外,其余avenin-like所编码的蛋白质序列均含有18个Cys,且位置相同,预测可能形成7个分子内二硫键和4个分子间二硫键;发现3条罕见的avenin-like假基因(JN542448、JN542455和JN542456),均因终止密码子的提前出现引起基因沉默;7份小麦品种共享一条avenin-like亚基,并与GenBank中来自普通小麦的HM027636完全一致,暂将该亚基命名为"Avenin-likeⅠ";系统演化分析表明avenin-like编码蛋白与LMW-GS关系最近,与ω-gliadin的亲缘关系最远;SDS-PAGE检测融合蛋白成功表达,对纯化蛋白进行微量掺粉试验,发现Avenin-likeⅠ型蛋白亚基对小麦加工品质具有显著的正向效应。【结论】avenin-like在供试小麦品种中具有很低的多态性,且Avenin-likeⅠ型亚基能提高面粉加工品质。
- 魏慧董剑陈其皎高翔王蕾李晓燕赵万春吴丹
- 关键词：小麦原核表达
- 黑麦籽粒Waxy蛋白亚基的高效分离与鉴定技术体系的构建被引量：1
- 2013年
- 【目的】构建用于制备级分离及高效鉴定黑麦籽粒Waxy蛋白亚基的技术体系,为该亚基理化特性的分析、功能的发掘及Waxy种质的快速筛选等提供理论参考。【方法】设计特异引物从灌浆期间的奥地利黑麦籽粒cDNA中克隆获得Waxy,并进行体外表达;利用DuoFlow对籽粒蛋白提取物进行纯化,对峰值收集物、原核表达产物及其Ni柱纯化的重组Waxy蛋白进行SDS-PAGE分离,挖取蛋白条带进行MALDI-TOF质谱鉴定,结合经由基因序列所推导的氨基酸序列,确定回收产物的Waxy蛋白属性;在优化电泳条件的基础上构建针对Waxy蛋白的毛细管电泳体系;同时,利用部分黑麦品种对DuoFlow及CE体系的有效性进行验证。【结果】核苷酸序列分析表明,从奥地利黑麦cDNA中克隆获得一条覆盖Waxy全长的编码序列(GenBank登录号:KF559182),其理论编码产物约为60 kD;利用DuoFlow Q1阳离子交换柱,以低浓度Tris-Hcl(20 mmol·L-1Tris-Hcl,pH 9.5)进行蛋白挂柱,高浓度NaCl(20 mmol·L-1Tris+1 mol·L-1NaCl,pH 9.5)进行蛋白洗脱,214 nm波长检测,实现了对籽粒Waxy蛋白的DuoFlow高效分离;纯化产物的SDS-PAGE条带大小、质谱鉴定肽段与黑麦、小麦Waxy蛋白序列相似性的统计结果表明,DuoFlow峰值回收产物具有黑麦Waxy亚基一致的特征序列,故属于Waxy蛋白;以DuoFlow纯化产物为标准样,以0.05 mmol·L-1硼砂+15%乙腈+1%SDS溶液(pH 9.5)为缓冲液,采用分离电压20 kV,温度25℃,检测波长214 nm,压力进样,0.5 psi×5 s,在11—12 min处获得峰值约12 mAU单一主峰,图形清晰,基线水平,从而构建了Waxy蛋白的CE鉴定体系,且籽粒Waxy蛋白提取物能直接用于对该亚基的检测;同时,利用黑麦品种对上述体系的验证结果表明,DuoFlow及CE体系适于对Waxy亚基的高效分离与通量检测。【结论】从奥地利栽培黑麦cDNA文库中克隆获得Waxy完整编码序列,构建了能特异分离黑麦籽粒Waxy蛋白的DuoFlow制备级纯化体系,
- 孟敏董剑高翔赵万春李晓燕陈其皎陈良国石引刚
- 关键词：WAXY蛋白毛细管电泳
- 小麦Waxy蛋白亚基毛细管电泳分离体系的构建被引量：1
- 2015年
- 为构建Waxy蛋白亚基的快速、高效、高通量毛细管电泳分离鉴定体系,为该亚基理化特性的分析、功能的发掘及含Waxy蛋白亚基种质的快速筛选提供参考依据,以小麦中国春为材料,采用逐一优化毛细管电泳体系参数的方法,系统研究了毛细管电泳中缓冲液各成分以及pH值对中国春中Waxy蛋白亚基出峰效果的影响,初步构建了普通小麦Waxy蛋白亚基的最佳分离体系。结果表明,在检测波长为214nm、以0.05mol·L-1硼砂＋8%乙腈＋0.8%SDS溶液（pH 9.5）为缓冲液、分离电压20kV、温度25℃、进样压力0.5psi×5s时,在6~9min处出现峰高约0.015au的三个主峰,且图形清晰,基线水平,重复性好。本研究构建的毛细管电泳系统分离体系可有效分离普通小麦Waxy蛋白亚基。
- 孟敏强琴琴高翔陈其皎董剑
- 关键词：小麦WAXY蛋白毛细管电泳缓冲液
- 低分子量谷蛋白亚基在小麦品种形成过程中的变化特征被引量：1
- 2013年
- 【目的】研究普通小麦品种选育过程中低分子量谷蛋白亚基(LMW-GS)的变化特性,理解该基因家族成员多样性的起源,并为小麦品质改良提供参考。【方法】以3套小麦高代杂交品系(F5/F6)为材料,利用毛细管电泳(CE)技术从储藏蛋白水平鉴定LMW-GS亚基的变化;根据GenBank中已公布的LMW-GS编码序列设计特异性引物,进行PCR扩增、克隆、测序及序列分析。【结果】毛细管电泳结果表明,与亲本相比,高代供试品系均保持了相对稳定的LMW-GS数目,但多个亚基在籽粒中的最终含量却发生明显变化;同时,测试品系还产生了亲本所不具有的新条带。对克隆获得的54条序列(GenBank登录号KC222070-KC222121和KC478714-KC478715)进行序列分析,均具有LMW-GS的典型结构,包括相对保守的信号肽、存在丰富变异的中间重复区及保守的C-端,因此属于LMW-GS基因家族成员;子代与对应亲本的相似性分析表明,3套材料中均存在极端保守序列,子代序列与其相应父本序列完全一致,且都属于LMW-m型亚基;相对保守序列所占比例最大,由于微弱的SNPs,双亲都充当变异序列的供体;蛋白质序列分析还揭示了额外Cys亚基的产生过程。此外,还发现含10个或11个半胱氨酸(Cys)残基的LMW-GS。Cys残基的变异主要发生在C-端Ⅲ区,只有1条序列的Cys变异发生在C-端Ⅱ区。【结论】小麦品种选育过程,父源性的LMW-m型低分子量谷蛋白亚基较其它类型亚基更趋于序列的保守,SNPs则是产生LMW-GS多样性的主要动力。
- 杨芮高翔陈其皎李晓燕董剑孟敏赵万春石引刚陈良国
- 关键词：小麦毛细管电泳多样性
- 小麦品种陕253新型avenin-like的克隆与原核表达分析被引量：3
- 2010年
- 【目的】克隆小麦品种陕253中的新型avenin-like(类燕麦储藏蛋白),并构建该基因的原核表达载体,在大肠杆菌中诱导表达融合蛋白。【方法】利用PCR方法从小麦品种陕253中克隆新型avenin-like,将克隆的avenin-like亚克隆至表达载体,经酶切及测序鉴定后,转化宿主菌Escherichia coli Rosetta-gami B(DE3),经IPTG诱导表达融合蛋白,并利用Western blot进行检测。【结果】从小麦品种陕253克隆获得3个新avenin-like,GenBank登录号分别为GQ903577、GQ903578和GQ903579。序列分析表明,其中GQ903579为假基因,利用所构建的大肠杆菌表达载体,经IPTG诱导,实现了对登录号为GQ903578的基因在原核系统的特异性表达。【结论】新型avenin-like的克隆及原核表达的成功,为小麦品质改良提供了研究基础。
- 陈瑞佶高翔陈其皎董剑赵万春李艳亮王明霞李敏庞红喜李哲清刘俊
- 关键词：基因克隆融合蛋白原核表达
- 一年生簇毛麦α-醇溶蛋白基因的分离、原核表达与功能鉴定被引量：2
- 2014年
- 醇溶蛋白是面筋的主要成分之一,对小麦品质具有重要影响。根据数据库中全长α-醇溶蛋白基因设计了1对通用引物,从5份一年生簇毛麦（Dasypyrum villosum）品系中共得到52条序列,长度在816～873 bp之间（GenBank登录号为 KJ004676～KJ004727）。核酸序列分析表明,其中有8条假基因,有1条（KJ004680）缺失终止密码子。推导氨基酸序列显示, KJ004677、KJ004686、KJ004714和KJ004696含有1个额外的Cys,其中,前3条序列由于Tyr→Cys所致,而KJ004696则由于Ser→Cys突变。序列间的差异主要出现在N-端重复区和多聚谷氨酰胺I区,根据N端重复区多肽序列的差异将一年生簇毛麦α-醇溶蛋白分为5种类型。为了分析具有额外Cys的α-醇溶蛋白所具有的品质效应,选取KJ004708（具有典型的6个Cys）和KJ004714（具有1个额外的Cys）分别构建表达载体, IPTG诱导后均得到分子量约30 kD的蛋白,与理论值相符；目的条带经切胶串联质谱鉴定证明,这2个α-醇溶蛋白基因在大肠杆菌中正确表达。对表达的蛋白亚基进行纯化、复性和低温冷冻干燥,经4 g粉质仪分析表明, KJ004708和KJ004714均能改善面团的加工品质,其中具有1个额外Cys的KJ004714亚基对面粉品质的改善更为显著。
- 杨帆陈其皎高翔赵万春强琴琴吴丹孟敏
- 关键词：原核表达
- 普通小麦中α-醇溶蛋白基因(GQ891685)的克隆、表达及品质效应鉴定被引量：12
- 2010年
- 【目的】利用E.coli体外大量高效表达带有1个额外半胱氨酸残基的α-醇溶蛋白,经Ni+-NTA柱纯化获得目标蛋白,通过氧化-还原反应将其整合到基础面粉中,利用粉质仪研究其对面团流变学特性的影响,以确定该基因表达产物的加工品质效应。【方法】根据α-醇溶蛋白基因编码区保守序列设计引物,从小麦品种陕253中克隆到1条含α-醇溶蛋白基因编码区的目的片段,长度为1243bp(GenBank登录号GQ891685),构建了该基因的原核表达载体pET32a-S253-Agli,在大肠杆菌E.coliBL21(DE3)中经IPTG诱导表达,对表达的蛋白进行亲和层析及低温冷冻干燥回收、纯化,通过微量掺粉试验,在4g粉质仪上测定其对面团流变学特性的影响。【结果】该基因片段包含900bp的完整编码序列及部分5′-调控元件;Uniq domainⅡ区第6位氨基酸密码子C→G的转换,导致丝氨酸Ser→半胱氨酸Cys的变化,这1额外的半胱氨酸将有可能参与形成1个分子间二硫键;用IPTG诱导表达,经SDS-PAGE及Western blotting检测,证实融合蛋白表达成功并主要以包涵体形式存在;粉质结果表明,添加S253-Agli蛋白虽然能够增加面团的带宽及机械耐力系数,却因显著缩短面团稳定时间及形成时间而对面团的粉质参数产生了总体的负面效应。【结论】具有1个额外半胱氨酸残基的α-醇溶蛋白GQ891685增强了面筋弹性,但降低了面筋强度。
- 李敏高翔陈其皎董剑赵万春王明霞
- 关键词：陕253融合蛋白原核表达
