国家自然科学基金(30300171)
- 作品数：10 被引量：16H指数：2
- 相关作者：王宝利郑纺李晓霞张镜宇邱明才更多>>
- 相关机构：天津医科大学天津医科大学总医院天津医科大学代谢病医院更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金天津市自然科学基金天津市高等学校科技发展基金计划项目更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学更多>>
- Osx cDNA反义表达载体的构建
- 2005年
- 目的:构建反义Osterix(Osx)cDNA表达载体。方法:快速提取人全血基因组DNA。以DNA为模板,经过两步PCR扩增获得Osx编码序列,与pGEMR-TEasy连接获得重组克隆载体。将Osx编码序列反向克隆入真核表达载体pcDNA3,进行序列测定。结果:经序列分析证实,Osx扩增序列完全正确,且反向插入到pcDNA3载体。结论:成功构建了Osx反义表达载体,为研究Osx对成骨细胞分化的影响奠定了基础。
- 郑纺王宝利郭刚
- 关键词：反义表达载体OSXPCDNA3成骨细胞分化克隆载体克隆人
- 前列腺素E2调节大鼠成骨细胞RANKL／OPGmRNA表达的信号通路研究被引量：2
- 2008年
- 目的探讨前列腺索E2（PGE2）对大鼠成骨细胞RANKL和OPGmRNA表达的调节及其信号转导机制。方法培养大鼠UMR106成骨细胞，采用不同浓度的PGE2、不同信号通路的激动剂和阻断剂干预细胞不同时间后收集细胞提取总RNA，实时荧光定量PCR检测RANKL和OPGmRNA的表达水平。结果PGE2、Forskolin和db—cAMP均可促进RANKLmRNA表达，抑制OPGmRNA的表达。PMA促进RANKL和OPGmRNA表达而A23187则下调RANKL和OPG表达。KT-5720下调PGE2诱导的RANKLmRNA表达约53％（P〈0．001），而chelerythrine、维拉帕米、W7、KN-62和PD98059则对PGE，诱导的RANKLmRNA表达无明显影响（P〉0．05）。KT-5720（P=0．01）、维拉帕米（P=0．029）和W7（P〈0．001）均能部分阻断PGE，对OPGmRNA表达的下调作用，KN-62、PD98059和chelerythrine则不影响PGE2对OPG表达的调节（P〉0．05）。结论PGE2诱导的RANKL表达是由PKA信号通路介导的，而PKA和钙／钙调蛋白信号通路则介导了PGE2对OPG表达的抑制作用。
- 权金星王宝利郑纺邱明才
- 关键词：前列腺素E2护骨素钙调蛋白
- 基于重组PCR法构建人骨保护素N端的酵母表达载体被引量：1
- 2006年
- 目的:构建骨保护素(OPG)N端片段的酵母表达载体。方法:OPGN端D1-D4域仅由2个外显子编码。以人基因组DNA为模板,PCR分别扩增外显子2和外显子3,并使外显子2的3′引物和外显子3的5′引物具有相互重叠的一段序列。以2种PCR产物混合物为模板,采用重组PCR扩增OPGN端编码序列,拟插入酵母分泌型表达载体pPIC9K。为使未来分泌表达产物具有完全正确的N末端,再次采用重组PCR策略,将pPIC9K信号肽裂解位点前的一段序列(含单一限制酶位点BamHⅠ)与OPGN端编码序列拼接在一起,从BamHⅠ和EcoRⅠ位点插入pPIC9K。结果:得到了OPGN端酵母表达载体,测序证实插入序列正确。结论:重组载体的获得为基因工程研制具有生物活性的OPGN端片段奠定了基础。
- 李晓霞朱志峰王宝利戴芳郭刚张镜宇
- 关键词：破骨细胞成骨细胞聚合酶链反应
- 人骨保护素N端片段在大肠杆菌中的表达及其活性分析被引量：1
- 2005年
- 骨保护素 (OPG)成熟肽N端D1～D4结构域仅由 2个外显子编码 .以人基因组DNA作为模板 ,采用重叠延伸PCR得到N端D1～D4域编码序列 ,并在其上游引入 2×His密码子序列 ,然后克隆入载体pQE 30进行表达 ,SDS PAGE表明 8×His融合蛋白主要以包涵体形式存在 ,可被抗OPG抗体识别 .变性条件下通过Ni NTA金属螯合亲和层析对表达产物进行纯化后再经梯度透析进行复性 ,采用破骨细胞样细胞 (osteoclast likecell ,OLC)诱导分化实验来检测重组蛋白的生物活性 ,证实单核 巨噬细胞集落刺激因子 (M CSF)和破骨细胞分化因子 (ODF)可协同促进多核OLC的生成 ,但加入重组OPG片段后 ,OLC生成显著减少 .
- 王宝利戴芳梁晖张瑞吴亚锋郭刚张镜宇
- 关键词：骨保护素活性分析
- 人破骨细胞分化因子基因启动子报告载体的构建
- 2006年
- 目的:构建能够报告人破骨细胞分化因子(ODF)基因启动子活性的表达载体。方法:以人基因组DNA为模板,PCR扩增含有ODF基因启动子的2段序列(-2433￣-1243bp和-1262￣+100bp),通过T-A克隆将这2个序列片段分别连接到pGEM"-TEasy克隆载体上。利用特定的限制性内切酶位点,将这2个序列片段酶切后进行正确拼接并定向克隆到不含启动子的pEGFP-1报告基因载体上。将该重组质粒pEGFP-1-ODF瞬时转染成骨细胞系UMR106,检测其能否在ODF基因启动子(-2358￣+100bp)的调控下表达报告基因增强型绿色荧光蛋白(EGFP)。结果:pEGFP-1-ODF经酶切鉴定和序列分析证实与设计完全一致。细胞瞬时转染结果表明,pEGFP-1-ODF转染的UMR106能表达EGFP。结论:人ODF基因启动子报告载体的成功构建,为进一步研究ODF基因表达转录水平的调控机制奠定了基础。
- 杨宇虹郑纺刘瑞王宝利
- 关键词：破骨细胞分化因子
- BMP2与BMP7嵌合表达产物可诱导成骨细胞分化被引量：4
- 2009年
- 目的:构建骨形态发生蛋白(BMP)2与BMP7嵌合表达的分泌型基因载体pcDNA3-BMP2/7,检测表达产物的成骨诱导活性。方法:聚合酶链反应(PCR)扩增BMP2与BMP7的成熟肽编码基因,利用重叠延伸PCR以柔性肽(Gly4Ser)3编码序列使两者嵌合并克隆到质粒pcDNA3/sec上,转染CHO-K1细胞筛选得到稳定克隆,以其条件培养基处理鼠胚胎成纤维细胞C3H10T1/2,通过RT-PCR研究BMP2/7嵌合表达产物的活性。结果:BMP2/7嵌合表达产物可以明显提高C3H10T1/2细胞碱性磷酸酶(Alkalinephos phatase,ALP)、骨钙素(Osteocalcin,Oc)成骨细胞表型基因以及特异性转录因子Runx2(runt-related transcription factor2)mRNA的表达(P<0.01)。结论:制备的BMP2/7嵌合表达产物能够形成异源二聚体,诱导非骨源性细胞向成骨细胞分化。
- 胡丽玲李晓霞张镜宇王宝利
- 关键词：骨形态发生蛋白质类成骨细胞细胞分化
- 前列腺素E2调节大鼠成骨细胞OCIL基因表达的信号通路研究被引量：2
- 2011年
- 探讨前列腺素E2（PGE2）对大鼠成骨细胞破骨细胞抑制性凝集素（osteoclast inhibitory lectin OCIL）mRNA表达的调节及其信号转导机制。培养大鼠原代成骨细胞和UMR106成骨细胞样细胞，采用不同浓度的PGE2和不同的信号通路调节剂干预细胞后，提取细胞总RNA，采用实时荧光定量PCR检测OCIL mRNA的表达水平。PGE2、蛋白激酶A（PKA）激动剂福司可林、db—cAMP和钙离子载体A23187均促进OCIL mRNA表达，OCIL mRNA最大上调幅度分别为对照组的2．38倍、4．2倍、4．5倍和5．1倍（均P〈0．01）。蛋白激酶c（PKC）激动剂PMA下调OCIL mRNA表达约50％（P〈0．01）。PKA抑制剂KT-5720、钙通道阻断剂维拉帕米、钙调蛋白抑制剂W7和丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）阻断剂PD98059分别下调PGE，诱导的OCIL mRNA表达约56％、40％、65％和60％（均P〈0．01）。PKC抑制剂白屈菜红碱促进PGE2诱导的OCIL mRNA表达约30％（P〈0．05）。PKA、MAPK和Ca^2＋／钙调蛋白信号通路介导了PGE2诱导的大鼠成骨细胞OCIL基因表达。
- 权金星王宝利郑纺邱明才
- 关键词：前列腺素E2信号通路成骨细胞
- 人肿瘤坏死因子受体的配体胞外段的原核表达及分析
- 2009年
- 新近报道糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体的配体(GITRL)具有抑制前体破骨细胞的作用,故命名为Osteostat,为深入研究其功能和机制,本研究原核表达人GITRL胞外段并进行活性分析。利用限制性内切酶Eco31I获得大肠杆菌偏嗜性GITRL的胞外段cDNA序列,构建了基于pQE-30Xa的原核表达载体,并在M15[pREP4]菌株中经IPTG诱导表达带有His融合标签的GITRL重组蛋白,主要以包涵体形式存在。经体外包涵体变性、复性及纯化后,采用SDS-PAGE和Western blotting进行分析和鉴定。同时建立了报告基因技术检测GITRL重组蛋白生物活性的方法,简单便捷、灵敏而且周期短,利用此方法分析了重组GITRL胞外段表达蛋白的生物活性。
- 焦艳丽郑纺李晓霞王宝利郭善一
- 关键词：原核表达报道基因
- 重组可溶性核因子κB受体活化因子体外抑制甲状旁腺激素诱导的破骨细胞生成被引量：4
- 2007年
- 新近发现的核因子κB受体活化因子配基(receptor activator of nuclear factor-κB ligand,RANKL),核因子κB受体活化因子(receptor activator ofnuclear factor-κB,RANK)／护骨素(osteoprotegerin,OPG)细胞因子系统提高了对破骨细胞生物学和骨稳态分子水平的认识。RANKL与RANK之间的相互作用决定了破骨细胞的分化。本研究通过体外实验评价可溶性RANK (soluble RANK,sRANK)是否可作为RANKL的拈抗剂下调破骨细胞生成和骨吸收陷窝的形成。构建sRANK的原核表达载体,转化入大肠杆菌表达菌株Origami B(DE3),成功表达了重组蛋白,亲和层析进行纯化。重组sRANK以剂量依赖方式抑制由甲状旁腺激素(parathyroid hormone,PTH)诱导的破骨细胞生成和骨吸收陷窝形成。RT-PCR实验证实,sRANK可显著抑制PTH刺激的小鼠骨髓细胞碳酸苷酶Ⅱ和抗酒石酸酸性磷酸酶mRNA的表达。结果表明,sRANK具有抗骨吸收功能,可能成为一种治疗以骨吸收加强为特征的骨疾病的新方法。
- 王宝利梁晖郑纺李晓霞刘玉冰戴晨琳
- 关键词：核因子ΚB受体活化因子破骨细胞体外
- 人骨保护素N端片段在大肠杆菌中的表达及其活性分析被引量：2
- 2006年
- OPG 成熟肽 N 端 D1～D4结构域仅由2个外显子编码．以人基因组 DNA 作为模板,PCR 分别扩增骨保护素基因外显子2和外显子3,再以2种 PCR 产物的混合物作为模板,采用重组 PCR 法得到 N 端 D1～D4域编码序列,使该序列与载体 pET42a 部分序列相连,然后克隆入载体 pET42a 进行表达,SDS-PAGE 表明产物主要以包涵体形式存在,可被抗 OPG 多克隆抗体识别．Glutathione Sepharose 4B 亲和层析纯化融合蛋白 GST-hOPG_(D1-4),Xa 切割祛除担体蛋白及进一步分离纯化．采用破骨细胞样细胞诱导分化实验来检测重组蛋白的生物活性,证实该重组蛋白可以抑制 OLC 的生成．
- 戴芳王宝利邱明才
- 关键词：骨保护素大肠杆菌
