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兔抗人β_2糖蛋白Ⅰ多克隆抗体的制备与鉴定被引量：9: 2009年; 目的制备兔抗人β2糖蛋白Ⅰ多克隆抗体,并鉴定抗体的特异性及功能活性。方法以纯化的人血浆β2糖蛋白Ⅰ(β2-GPI)免疫新西兰大白兔,获得抗血清;利用Protein A及β2-GPI亲和层析柱纯化血清中总IgG和抗β2-GPI多克隆抗体;用免疫双向扩散试验(IDD)、ELISA和western-blot等方法鉴定抗体。结果IDD及ELISA鉴定抗体效价分别达到16和1×105;western-blot显示纯化的总IgG和抗β2-GPI抗体与β2-GPI蛋白均有特异反应条带;且抗体与β2-GPI复合物能够刺激单核细胞株THP-1表达组织因子(TF)活性。结论成功获得并纯化兔抗人β2-GPI多克隆抗体,为进一步研究β2-GPI/抗β2-GPI复合物在抗磷脂抗体综合征血栓形成机制中的作用建立了基础。; 黄宏亮周红俞颖李娜石文霞王婷王海波; 关键词：多克隆抗体抗磷脂抗体综合征

ANX A2在抗磷脂抗体诱导THP-1细胞组织因子表达中的作用被引量：2: 2009年; 目的:构建针对人膜联蛋白A2(ANXA2)的RNA干扰(RNAi)慢病毒表达载体,转染THP-1细胞,探讨ANXA2在抗磷脂抗体(APL)诱导单核细胞组织因子(TF)表达中的作用。方法:设计4条ANXA2特异性RNAi的寡核苷酸序列,与慢病毒载体pGCSIL-GFP连接,PCR及测序鉴定正确后,Western蛋白印迹法筛选出有效干扰序列。包装293T细胞获得重组慢病毒LV-RNAi-ANXA2,感染单核细胞株THP-1,观察细胞ANXA2 mRNA和蛋白表达下降程度。再用APL/β2GPI复合物刺激干扰后的THP-1细胞,观察TFmRNA表达及TF活性变化。结果:成功构建RNAi慢病毒载体并筛选出有效干扰片段;包装293T细胞后病毒滴度为3×1012TU/L;感染THP-1后细胞ANXA2 mRNA和蛋白均被沉默。APL/β2GPI复合物刺激干扰后的THP-1细胞,其TF表达下降至基础水平。结论:构建的慢病毒表达载体能显著抑制THP-1细胞ANXA2的表达,进而影响APL诱导的TF表达,证明ANXA2在APL诱导的单核细胞表达TF过程中具有重要作用。; 李娜周红俞颖王婷黄宏亮石文霞王海波; 关键词：膜联蛋白A2 抗磷脂抗体

膜联蛋白A_2介导β_2糖蛋白Ⅰ/抗β_2糖蛋白Ⅰ复合物刺激单核细胞上调表达组织因子被引量：2: 2010年; 目的探讨膜联蛋白A2是否介导β2糖蛋白Ⅰ(β2GPⅠ)/抗β2糖蛋白Ⅰ结合于单核细胞表面,从而诱导单核细胞表达组织因子。方法利用纯化的抗磷脂综合征(APS)患者血清IgG、单克隆抗β2糖蛋白Ⅰ抗体、抗膜联蛋白A2抗体等刺激血液单核细胞及THP-1单核细胞株,通过凝血因子Ⅹa的生成量,判断细胞组织因子活性的表达;把带有膜联蛋白A2cDNA的载体转染入HEK293T细胞,然后用β2糖蛋白Ⅰ/抗β2糖蛋白Ⅰ复合物刺激,观察转染前后HEK293T细胞的组织因子表达情况;采用RNA干扰技术封闭单核细胞株THP-1膜表面的膜联蛋白A2,观察组织因子的表达情况。结果 APS患者血清IgG和抗β2糖蛋白Ⅰ抗体显著增强单核细胞组织因子的表达;HEK293T细胞转染膜联蛋白A2cDNA后组织因子的mRNA和蛋白的表达量较转染前增高;采用RNA干扰降低膜联蛋白A2表达后单核细胞株THP-1的组织因子表达显著降低。结论细胞表面膜联蛋白A2介导β2糖蛋白Ⅰ/抗β2糖蛋白Ⅰ诱导单核细胞表达组织因子活性,是APS血栓形成的机制之一。; 俞颖谭潘丽钱丽丽; 关键词：单核细胞凝血致活酶膜联蛋白A2

真核表达质粒pIRES_2-eGFP-Annexin A2的构建及其在293T细胞中的表达被引量：1: 2009年; 目的:构建含有人Annexin A2基因的真核表达质粒pIRES2-eGFP-Annexin A2,并在真核细胞293T中表达。方法:将质粒pCMV5-Annexin A2上Annexin A2基因酶切后与真核表达质粒pIRES2-eGFP连接,酶切鉴定及测序正确后,脂质体介导法转染293T细胞,荧光定量PCR及蛋白质印迹法检测其基因和蛋白的表达。结果:构建的质粒pIRES2-eGFP-Annexin A2转染293T细胞后,目的基因mRNA和蛋白表达均明显增高。结论:成功构建pIRES2-eGFP-Annexin A2质粒并表达蛋白,为研究Annexin A2的生物学功能奠定了基础。; 李娜周红俞颖王婷黄宏亮石文霞王海波; 关键词：ANNEXIN 真核表达抗磷脂综合征

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浙江省自然科学基金(Y206830)