国家自然科学基金(30600430)
- 作品数：13 被引量：39H指数：4
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- 获能处理对山羊精子结合外源DNA能力的影响
- 2009年
- 鲜精离心洗涤除去精浆,然后用0.4μmol/L钙离子载体(IA组)作用10 min或用10 mg/L肝素(HE组)作用90 min获能后,与DNA孵育,再用地高锌(DIG)末端标记的线形外源DNA进行转染,用免疫组化的方法分别检测它们的转染效率;用透射电镜观察精子获能前后的超微结构变化,并用碘化丙锭和羟化荧光素双探针检测获能对精子质膜完整性的影响,探讨精子获能影响精子结合及内化外源DNA变化的原因。结果显示,获能处理降低了精子结合和内化外源DNA能力,IA组和HE组结合率分别为(17.41±4.69)%和(15.00±4.36)%,都极显著低于未经获能处理的精子(32.97±4.58)%(P<0.01)。IA组、HE组和对照组(未获能)内化率分别为(12.09±2.50)%、(8.93±1.79)%和(25.52±2.57)%,IA组、HE组均极差异小于对照组(P<0.01)。超微结构观察和双荧光探针检测都发现精子获能后质膜完整性降低。用IA或HE获能后的精子质膜完整率是分别是(33.16±6.46)%和(33.90±4.14)%,与对照组差异极显著(P<0.01)。结果表明,精子结合及内化外源DNA不是纯粹的分子渗透现象,而是受严格的分子调控的。
- 赵永聚王炜王剑孙新明张家骅
- 关键词：山羊精子体外获能外源DNA质膜
- 奶牛性控冷冻精液品质和转染外源DNA的特点被引量：1
- 2010年
- 本研究分析了奶牛性控冻精与普通冻精解冻后精液品质和转染外源DNA的特点。奶牛性控冻精与普通冻精解冻后,分别检测精液品质和精子超微结构,并与地高辛标记的线性化pEGFP-N1质粒共育转染,用免疫组化的方法检测精子转染外源DNA的效率。结果表明:性控冻精与普通冻精相比,有效精子数少(P<0.01),精子活力、顶体完整率差(P<0.05);2组精子超微结构都出现一定程度的顶体破裂、脱落等形态变化;2组精子都具有自动结合和转运外源DNA的能力,性控冻精转染率极显著高于普通冻精(P<0.01),分别为(11.34%±2.41%)和(7.30%±2.14%)。
- 王岭斌于明举范景胜赵永聚
- 关键词：性控精液冷冻保存外源DNA奶牛
- 免疫组化检测CD4蛋白在不同物种生精过程中的表达
- ＜正＞引言1971年Brackett发现哺乳动物精子可携带外源DNA,1989年Arezzo发现借助于精子载体可将外源质粒带入卵子,并可在胚胎中表达;同年lavitrano以小鼠精子为外源基因载体,获得了30%的阳性小鼠...
- 于明举王岭斌陈俊颖罗艳梅赵从赵永聚
- 关键词：山羊CD4免疫组化生精过程蛋白表达
- 文献传递
- 脂质体介导外源基因体外转染山羊精子的研究
- 2009年
- 实验以山羊精子为对象,研究脂质体介导精子转染外源基因的效率和对生产阳性胚胎的影响.山羊鲜精离心洗涤除去精浆,分别用地高锌(DIG)末端标记的线形外源DNA与精子直接共育(对照组),阳离子脂质体Lipo-fectamineTM-DNA复合体与精子共育(实验组),用免疫组化的方法分别检测它们的转染效率;用成熟卵母细胞与转染外源DNA并已获能的精子行体外受精,PCR方法检测生产阳性胚胎的效率.结果发现添加阳离子脂质体对提高山羊精子结合外源DNA和生产阳性胚胎的效率不显著(p>0.05),对照组和实验组阳性精子率、DNaseⅠ消化后内化率与胚胎PCR阳性率分别为(47.56±3.09)%和(42.54±6.08)%、(26.67±2.40)%和(24.33±2.67)%、24.24%和22.73%,同时还发现添加阳离子脂质体对山羊精子活力和体外受精能力影响不显著(p>0.05).
- 郑双艳赵永聚李娟王炜王剑
- 关键词：山羊精子脂质体外源DNA体外受精
- 不同处理对山羊精子转染外源DNA效率的影响被引量：2
- 2009年
- 将采集的山羊精液去除精清,分为鲜精组、冻精组、反复冻融致死组3组进行处理后,与地高辛标记的线性化PCS2EGFP质粒共育转染,用免疫组化的方法检测精子转染外源DNA的效率.结果显示鲜精、冻精和反复冻融致死3种处理组的阳性转染效率分别为(36.61±7.91)%,(32.68±3.38)%,(69.36±4.79)%.反复冻融致死组转染率极显著高于鲜精组和冻精组(p<0.01),鲜精组和冻精组转染效率差异不显著(p>0.05).
- 范景胜赵永聚徐恢仲王岭斌于明举
- 关键词：山羊精子外源DNA转染
- 山羊CD4基因的克隆及组织表达分析被引量：4
- 2012年
- CD4基因是质膜上的转运系统之一,为动物辅助性T细胞(TH)和部分胸腺细胞的共受体与信号传导分子,参与TCR介导的TH细胞活化和胸腺细胞分化过程.该研究首次克隆了山羊CD4基因(GenBank登录号:EU913093),并分析了该基因的组织表达情况.结果表明:所克隆的山羊CD4全长cDNA序列为1 555bp,开放阅读框(ORF)为1 368bp,编码455个氨基酸的蛋白,相对分子质量为5.05×104,等电点为9.52.山羊CD4蛋白前体由信号肽、胞外区、跨膜区和胞浆区4个部分构成.胞外区含有4个Ig样结构域,2个二硫键(C41—C109和C143—C180)及3个N糖基化位点(N231,N263和N343).氨基酸序列比对表明山羊CD4与绵羊CD4的氨基酸相似性为98%,与猪、人、兔、狗、猫、蝙蝠以及小鼠的氨基酸相似性分别为81%,74%,73%,72%,70%,70%和66%.系统发育树表明山羊CD4与绵羊和猪的CD4蛋白聚成一支,表明它们有较近的亲缘关系,其中山羊与绵羊的亲缘关系最近,而与狗、蝙蝠、兔、人和小鼠的亲缘关系相对较远.实时荧光定量PCR分析发现,CD4在山羊淋巴中的表达量最高,在睾丸中表达量较低,表明山羊CD4是一种免疫分子.
- 郑双艳赵永聚许宝华王子龙李娟
- 关键词：山羊克隆结构域实时荧光定量PCR
- 精子结合与内化外源DNA的分子机制研究进展被引量：1
- 2010年
- 精子具有主动结合、转运、整合外源DNA的能力,并能在受精时导入卵母细胞,获得转基因动物。精子介导基因转移(sperm-mediated gene transfer,SMGT)是目前获得转基因动物简单而高效的方法之一,但该方法存在着极大的随机性和不确定性。研究精子结合与内化外源DNA的分子机制、外源DNA进入精子后的定位及命运,对提高利用SMGT方法生产转基因动物效率和稳定性是十分重要的。精子与外源DNA的结合、内化和整合是受到严格调控的一种现象。
- 赵永聚魏泓
- 关键词：外源DNA精子内化分子机制
- 精子因素对精子载体法制备转基因山羊的影响被引量：7
- 2009年
- 精子具有主动结合、转运、整合外源DNA的能力,并在受精时导入卵母细胞,获得转基因动物。精子介导基因转移(sperm-mediated gene transfer,SMGT)是目前获得转基因动物简单而高效的方法之一。精子因素是影响SMGT方法生产转基因动物的重要方面。本论文结合我们的研究针对转染用山羊(Caprahircus)精液的来源、精子质膜完整性、精液品质及发育阶段等精子因素影响精子结合外源DNA和SMGT方法生产转基因山羊的效率进行了论述,并从这些影响因素入手,提出了筛选精子供体、保持精液品质、调控质膜等措施,提高精子转染外源DNA能力和生产转基因动物的效率。
- 赵永聚
- 关键词：山羊外源DNA精子供体精子载体法
- 冷冻对山羊精子转染外源DNA和体外制备转基因胚胎的影响被引量：3
- 2008年
- 本实验将鲜精和冻精分别与地高锌标记的线形化的pEGFP-N1质粒孵育转染,用原位杂交方法检测转染效率;PCR和Southern Blotting检测精子与外源DNA的整合效率;与成熟卵母细胞体外受精,PCR检测阳性胚胎比率,用透射电镜技术、碘化丙锭和羟化荧光素双探针技术和单细胞电泳(Single Cell Gel Electrophoresis,SCGE)技术,观察精子冷冻前后的超微结构、精子质膜完整性和精子核DNA损伤的变化,研究冷冻对山羊(Caprahircus)精子转染内化外源DNA和体外制备转基因胚胎的影响及机理。结果表明,冻精显著提高了转染外源DNA的效率(81.60%±16.59%vs32.95%±2.93%,t=4.873,P=0.003;41.80%±6.26%vs27.89%±8.64%,t=2.634,P=0.039)。PCR和Southern Blotting检测表明外源DNA已经整合到精子基因组上。用冻精与成熟卵母细胞体外受精,体外受精穿透率和卵裂率显著低于鲜精组(24.19%±3.15%vs58.86%±3.73%,t=7.131,P<0.001;11.83%±2.37%vs29.71±3.47%,t=4.302,P<0.001),但体外生产的胚胎PCR阳性率比鲜精组显著提高(45.45%±10.87%vs24.44%±6.06%,t=1.750,P=0.013)。超微结构观察和双荧光探针检测都发现冷冻-解冻精子质膜完整性降低(8.34%±4.21%vs65.67%±6.46%,t=12.492,P<0.001),SCGE显示冷冻极显著增加了精子彗尾长度和彗星细胞比例(42.67μm±4.56μmvs21.14μm±2.36μm,t=5.644,P=0.005;60.00%±4.00%vs17.37%±2.57%;t=15.787,P<0.001)。冷冻-解冻可以提高山羊精子转染外源DNA的效率,冷冻破坏精子质膜完整性,解除质膜的阻碍作用,是提高外源DNA转染效率的一个主要原因。
- 赵永聚王勇王剑李福兵魏泓
- 关键词：山羊精子外源DNA冷冻体外胚胎生产质膜
- 夏季山羊精液不同保存方法研究被引量：4
- 2010年
- 假阴道法采集重庆市大足黑山羊精液,分析鲜精精液品质,采取随机单位组两因素三水平无重复观察值方差分析试验设计,应用常温保存(20℃)、低温冷藏(4℃)和精液冷冻3种方式进行精液保存效果及对精液品质影响的研究.两因素分别为稀释液和精子密度,每个因素选择3个水平,以生存指数作为评价精液保存效果的指标.新鲜精液采集后检测发现品质良好,活力均值为0.87,畸形率为9.45%,符合GB20557-2006做山羊冻精标准.与去年同期比较,发现高温可造成精液品质下降.稀释液对3种保存效果影响差异均不显著(p>0.05),精子密度对常温保存和低温冷藏影响差异极显著(p<0.01),对冷冻影响差异不显著(p>0.05).不同处理均造成精液品质下降,其中冷冻造成影响极显著.常温和冷藏下以稀释液A1、精子密度1×109个/mL保存较好,冷冻保存以稀释液A2、精子密度2×108个/mL较好.
- 罗艳梅于明举赵永聚王岭斌赵从谢畅穆飙张家骅
- 关键词：精液保存夏季山羊
