广东省自然科学基金(20003026)
- 作品数：6 被引量：20H指数：3
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- 相关机构：中山大学广东药学院更多>>
- 发文基金：广东省自然科学基金国家教育部博士点基金更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学更多>>
- 华支睾吸虫成虫RPEF基因的克隆和表达被引量：3
- 2004年
- 目的 构建华支睾吸虫成虫RNA聚合酶Ⅱ延长因子 (RPEF)基因重组质粒 ,分析其编码序列 ,并进行大肠杆菌原核重组表达和免疫鉴定。方法 根据RPEF基因已知序列设计一对引物 ,用常规PCR技术从华支睾吸虫质粒文库模板中扩增RPEF基因片段 ;将目的基因PCR产物和空质粒 pGEX 4T 1同时用BamHⅠ和SalⅠ限制性内切酶双酶切 ,纯化回收后建立连接反应并转化大肠杆菌BL2 1。将构建的重组质粒pGEX 4T 1 RPEF双酶切、PCR、测序鉴定正确后在BL2 1中诱导表达 ,SDS PAGE电泳和Western blot方法鉴定其原核表达效果。结果 成功构建出RPEF基因原核重组质粒 pGEX 4T 1 RPEF。SDS PAGE分析显示RPEF基因在大肠杆菌BL2 1系统中得以高效表达 ,其融合蛋白分子量大约 4 5kD ,与理论值相符。Western blot的结果显示此RPEF融合蛋白可被山羊GST单抗所识别 ,融合蛋白具有GST免疫反应性。结论 筛选到华支睾吸虫RNA聚合酶Ⅱ延长因子 (RPEF)基因 ,并成功构建原核表达载体及在E .coliBL2 1系统中高效表达。
- 张咏莉余新炳吴德吴忠道毕惠祥陈明志
- 关键词：华支睾吸虫原核表达免疫印迹
- 华支睾吸虫成虫转录辅激活因子基因在原核细胞中的克隆、表达及其生物功能分析被引量：3
- 2005年
- 目的 构建华支睾吸虫成虫转录辅激活因子 (transcriptionalcoactivator ,TC)基因 (TC基因 )原核重组质粒 ,进行原核表达、鉴定及生物功能分析。 方法 根据TC基因已知序列设计 1对引物 ,从华支睾吸虫成虫cDNA文库中扩增TC基因片段 ;将目的基因进行聚合酶链反应 (PCR) ,其产物和空质粒 pGEX 4T 1、pET3 0a (+ )同时用限制性内切酶BamHⅠ、SalⅠ双酶切 ,纯化回收后连接并转化大肠埃希菌 (E .coliBL2 1)。将构建的重组质粒pGEX 4T 1 TC和 pET3 0a (+ ) TC分别经双酶切、PCR及测序鉴定后在大肠埃希菌BL2 1中诱导表达。用十二烷基磺酸钠 聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS PAGE)和蛋白质印迹法 (Westernblotting)鉴定其表达效果 ,用亲和层析法纯化重组质粒pET3 0a (+ ) TC表达产生的组氨酸重组蛋白 (His TC)。 结果 构建了TC基因原核重组质粒pGEX 4T 1 TC和 pET3 0a (+ ) TC。SDS PAGE结果表明TC基因在大肠埃希菌BL2 1系统获得高效表达 ,其重组蛋白分子量与理论值相符。Westernblotting结果表明重组质粒 pGEX 4T 1 TC表达的谷胱甘肽硫转移酶 (GST)重组蛋白(GST TC)可被华支睾吸虫免疫兔血清识别 ,具有免疫反应性。纯化的TC基因的组氨酸 (His)重组蛋白 (His TC)经SDS PAGE显示单一条带。
- 张咏莉余新炳吴德吴忠道毕惠祥
- 关键词：华支睾吸虫基因大肠埃希菌辅激活因子
- 华支睾吸虫成虫RPEF基因产物及其抗RPEF多克隆抗体的制备
- 2009年
- 目的体外制备华支睾吸虫成虫RNA聚合酶Ⅱ延长因子（RPEF）基因产物及抗RPEF多克隆抗体。方法亲和纯化试剂盒纯化表达蛋白pGEx4T-1，RPEF，凝血酶酶切表达蛋白制备重组蛋白RPEF，将重组蛋白RPEF免疫小鼠，制备多克隆抗血清，检测抗体滴度和抗血清特异性。结果体外制备的RPEF蛋白经SDS电泳呈单一条带；酶联免疫吸附结果显示，免疫过程抗体滴度呈连续上升趋势；免疫印迹结果显示，小鼠抗血清具有抗RPEF特异性。结论获得较专一的华支睾吸虫RPEF蛋白和RPEF抗血清。
- 张咏莉吴德胡旭初郑焕钦徐劲余新炳
- 关键词：华支睾吸虫基因产物抗血清多克隆抗体
- 华支睾吸虫3-磷酸甘油醛脱氢酶重组蛋白的纯化、酶学活性及免疫学研究被引量：11
- 2005年
- 目的体外制备华支睾吸虫3-磷酸甘油醛脱氢酶重组蛋白(CsGAPDH),分析其酶学活性及免疫学特性。方法常规表达重组质粒pGEX-4T-1-GAPDH,用谷胱甘肽-S-转移酶(GST)亲和纯化试剂盒纯化重组蛋白,经十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE),用凝血酶和纯化柱酶切、纯化的CsGAPDH免疫BALB/c小鼠,制备抗血清。ELISA检测抗IgG抗体滴度,浓缩型S-P免疫组化3步法检测CsGAPDH抗原在免疫小鼠体内的分布和表达。蛋白质印迹法(Western blotting)鉴定其抗血清的特异性。建立酶反应体系测定重组蛋白CsGAPDH的酶催化活性。结果纯化蛋白样品呈单一条带。免疫动物获取CsGAPDH抗血清,在免疫过程中抗体滴度呈连续上升趋势。CsGAPDH抗原分布和表达于小鼠肌细胞膜部位。免疫小鼠血清具有抗CsGAPDH特异性抗体。重组蛋白CsGAPDH具有酶生理活性,其酶活力单位为2 872 U min-1.ml-1。结论制备的重组蛋白CsGAPD H具有较好的酶活性和免疫原性。
- 张咏莉吴德余新炳
- 关键词：3-磷酸甘油醛脱氢酶蛋白质印迹法免疫原性
- 华支睾吸虫CsTC基因产物的体外制备及免疫学研究被引量：2
- 2007年
- 目的体外制备华支睾吸虫CsTC基因工程蛋白,并进行免疫学研究。方法用组氨酸标签亲和纯化试剂盒纯化重组蛋白CsTC。将CsTC蛋白免疫BALB/c小鼠,制备其多抗血清。酶联免疫吸附(ELISA)检测抗血清抗体滴度,蛋白质印迹法(Western blotting)鉴定其抗血清的特异性。结果纯化蛋白CsTC的浓度为(0.78±0.03)mg/ml,纯度达90%。间接ELISA结果显示,免疫过程中抗体滴度持续上升。Western-blot结果显示,免疫小鼠血清具有抗CsTC特异性。结论本研究制备的CsTC基因工程蛋白和抗CsTC抗血清可较好地用于后续CsTC的基因功能鉴定。
- 张咏莉吴德徐劲吴忠道余新炳
- 关键词：华支睾吸虫免疫印迹
- 华支睾吸虫RPEF基因的克隆与序列分析被引量：5
- 2004年
- 目的 构建华支睾吸虫成虫RNA聚合酶Ⅱ延长因子(RPEF)基因PET重组质粒,分析其编码序列。方法 根据RPEF基因已知序列设计一对引物,用PCR技术从华支睾吸虫质粒文库模板中扩增RPEF基因片段;将目的基因PCR产物和空质粒PET30a(+)同时用BamHⅠ和SalⅠ限制性内切酶双酶切,纯化回收后建立连接反应并转化大肠杆菌BL21。将构建的重组质粒PET30a(+)-RPEF经双酶切、PCR、测序鉴定后证明获得正确的重组克隆。结果 成功构建出RPEF基因原核重组质粒PET30a(+)-RPEF。序列分析表明,RPEF蛋白与鼠类RNApolymerase Ⅱ延长因子具有很高的同源性。结论 RPEF基因在华支睾吸虫基因表达调控机制中可能起重要作用。RPEF基因重组表达载体地PET30a(+)-RPEF的成功构建可为更深入地分析其基因功能、肝吸虫病药物靶标的筛选奠定基础。
- 张咏莉余新炳吴德吴忠道毕惠祥
- 关键词：华支睾吸虫
