国家自然科学基金(30170855)
- 作品数：8 被引量：72H指数：7
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- 融合表达Ag85B-ESAT6的结核分枝杆菌真核表达载体的构建及其免疫原性被引量：10
- 2004年
- 目的 :构建融合表达结核分枝杆菌 (Mycobacteriumtuberculosis,MTB)分泌蛋白Ag85B ESAT6真核表达载体 ,研究该重组载体在体外的表达和在小鼠体内诱生体液免疫应答的能力 .方法 :设计含不同酶切位点的Ag85B和ESAT6引物 ,采用PCR的方法从MTB毒株H37Rv DNA中分别扩增出相应大小的DNA片段 ,将片段分别与pGEM T easy载体连接后测序 .将测序正确的Ag85B和ESAT6按照不同的酶切位点克隆入真核表达载体pcDNA3,挑选出阳性克隆 ,分别命名为AZ pcD NA3 EF 和EZ pcDNA3 AF,将重组质粒电转CHO细胞 ,RT PCR检测融合蛋白mRNA的表达 ,间接免疫荧光测定CHO细胞内融合蛋白的表达 ;用重组质粒免疫BALB/c小鼠 ,ELISA测定特异性抗体的滴度 .结果 :PCR获得的Ag85B和ESAT6序列与GenBank报道的一致 .RT PCR可检测融合基因转录出mR NA ,转染重组质粒的CHO细胞内有较强的免疫荧光 ,AZ pcD NA3 EF 质粒免疫小鼠血清特异性抗体滴度为 1∶1 0 0 0 ,EZ pcD NA3 AF 质粒免疫小鼠血清特异性抗体滴度为 1∶1 5 0 0 .结论 :Ag85B和ESAT6融合基因真核表达载体构建成功 。
- 师长宏范雄林徐志凯李元柏银兰薛莹
- 关键词：分枝杆菌结核ESAT6
- 结核分枝杆菌分泌蛋白Ag85B-ESAT6的融合表达及纯化被引量：12
- 2004年
- 目的 融合表达结核分枝杆菌分泌蛋白Ag85B ESAT6 ,为结核病的预防提供有效亚单位疫苗。方法 设计含不同酶切位点的Ag85B和ESAT6引物 ,采用聚合酶链反应 (polymerasechainreaction ,PCR)的方法从结核分枝杆菌毒株H3 7Rv DNA中分别扩增出相应大小的DNA片段 ,将片段分别与PGEM T easy载体连接测序。将测序正确的Ag85B和ESAT6按照不同的酶切位点克隆入PPROEXHT表达载体 ,挑选出阳性克隆 ,将诱导的表达产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS PAGE)分析 ,同时与含6个组氨酸 (histidine 6×his)的单克隆抗体 (monoclonalantibody ,mAb)进行固定化蛋白质免疫学测定(Western blot) ,将用含Ni+鳌合剂的Ni NTA亲合柱纯化的表达产物免疫小鼠 ,用结核分枝杆菌培养上清滤液蛋白 (culturefiltrateproteins ,CFP)作为抗原 ,酶联免疫吸附试验 (enzyme linkedimmunosorbentassay ,ELISA)测定免疫小鼠血清特异性抗体的滴度。结果 PCR获得的Ag85B和ESAT6序列与基因文库 (GenBank)报道的完全一致。两者在大肠杆菌DH5α株中融合表达的产物约为 370 0 0 ,与预计大小相吻合。Western blot结果显示 ,在相对分子量约 370 0 0处有表达产物与 6×hismAb特异性结合带。表达产物为包涵体 ,通过Ni NTA纯化系统 ,可得到纯化的目的蛋白。
- 师长宏范雄林徐志凯李元柏银兰薛莹
- 关键词：结核分枝杆菌纯化结核病
- 结核分枝杆菌Ag85B基因疫苗免疫保护作用的初步研究被引量：11
- 2003年
- 目的:研究编码结核分枝杆菌分泌蛋白Ag85B的基因疫苗pTB30m和pTB30s对免疫动物的保护作用。方法:以基因疫苗pTB30m和pTB30s肌注免疫BALB/c小鼠。免疫完成6 wk后,用5×105 CFU的MTB H37Rv毒株经小鼠尾静脉攻击感染。同时用尼龙毛柱分离基因免疫BALB/c小鼠的T细胞,并以5×106 T细胞/只小鼠过继免疫正常BALB/c小鼠,立即用105 CFU的MTB毒株经小鼠尾静脉攻击感染。4 wk后分别计数脾脏中的细菌负荷。结果:与生理盐水对照组相比较,pTB30m及pTB30s质粒免疫组BALB/c小鼠脾脏中的细菌负荷均减少,分别为0.645(log10 CFU,P<0.01)和0.839(log10CFU,P<0.001);而空质粒对照组小鼠脾脏中的细菌负荷减少较少。经质粒pTB30m和pTB30s免疫的BALB/c小鼠的T细胞,过继免疫的正常BALB/c小鼠,对攻击感染的MTB H37Rv毒株在脾脏中的增殖具有部分抑制作用。结论:pTB30s免疫的BALB/c小鼠,对MTB H37 Rv毒株攻击的保护作用优于pTB30m质粒免疫,有望进一步用于结核病的防治研究。
- 范雄林徐志凯李元李别虎薛莹柏银兰白光春贾向志
- 关键词：结核分枝杆菌AG85B基因疫苗免疫保护作用
- 结核分枝杆菌esat-6基因疫苗的构建和免疫原性的研究被引量：9
- 2004年
- 目的 构建以结核分枝杆菌H3 7Rvesat - 6基因为基础的基因疫苗 ,并研究其免疫原性。方法 采用BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切含有esat- 6目的基因的质粒pGEM -Teasy -esat6 ,10 g L-1琼脂糖凝胶电泳回收约 30 0bp大小片段 ,以亚克隆法构建于真核表达载体 pcDNA3 1的相应酶切位点阳性克隆经酶切鉴定证实。重组表达质粒肌注免疫BALB/c小鼠三次 ,每次间隔 2周 ,ELISA检测小鼠血清中产生抗体的水平。结果 用BamHⅠ和EcoRⅠ酶切鉴定证实目的基因正确插入载体 ,命名为pcDE6 ,重组质粒免疫小鼠体内产生特异性抗体。结论 所构建的重组真核表达质粒pcDE6能引起免疫动物的特异性体液免疫反应 ,应进一步研究其刺激机体的细胞免疫应答 ,以用于结核病 (TB)
- 王丽梅范雄林师长宏李元柏银兰薛莹徐志凯
- 关键词：结核分枝杆菌基因疫苗免疫原性ESAT-6
- Th1型细胞因子基因对结核分枝杆菌基因疫苗诱导BALB/c小鼠产生抗CFP10抗体水平的影响被引量：8
- 2003年
- 目的 :研究分别表达含IL 12和IL 18基因的质粒 ,对结核分枝杆菌 (Mycobacteriumtuberculosis,MTB)H3 7Rv 株CFP10基因疫苗诱导免疫应答的影响。方法 :从正常人外周血单个核细胞 (PMBCs)中提取RNA ,用RT PCR扩增IL 18cDNA ,并克隆入载体 pGEM Teasy中。测序证实后 ,亚克隆至真核表达载体 pcDNA3.1的BamHI和EcoRI酶切位点。将分别表达小鼠IL 12和人IL 18基因的真核表达质粒pcmIL12和pcIL18,与MTBCFP10基因疫苗联合肌注免疫BALB/c小鼠 ,共免疫 3次 ,每次间隔 2wk。每次免疫后 2wk采血、分离血清 ,用ELISA检测小鼠血清抗CFP10抗体的滴度。结果 :用RT PCR成功地从人PMBC的RNA中扩增出IL 18cDNA ,测序结果正确。用BamHI和EcoRI酶切鉴定证实 ,目的基因已插入载体 pcDNA3.1中 ,阳性克隆命名为pcIL18。pc CFP10组第 1次免疫后 ,血清抗CFP10抗体的平均滴度为 1∶6 0 0 ,末次免疫后的滴度为 1∶4 0 0 0。pcIL18+pcCFP10组联合免疫后 ,血清抗CFP10抗体的滴度高于 pcCFP10组 ,最终达 1∶80 0 0。而pcmIL12 + pcCFP10组联合免疫后滴度仅为 1∶2 0 0。结论 :pcIL18与CFP10基因疫苗联合免疫 ,可增强CFP10抗原的特异性体液免疫应答 ;pcmIL12则可使CFP10基因疫苗产生的抗体水平降低。pcIL18+ pcCFP10基因联合免疫是否具有?
- 范雄林王丽梅王福祥师长宏李元薛莹柏银兰徐志凯
- 关键词：CFP10基因疫苗
- 结核分枝杆菌Ag85B-ESAT6融合蛋白在小鼠体内诱导的免疫应答及其保护力被引量：15
- 2004年
- 目的 :研究Ag85B与ESAT6融合蛋白在小鼠体内诱导的体液和细胞免疫应答以及对MTB感染小鼠的保护力 .方法 :采用皮下包埋的方法 ,将预先转移到硝酸纤维素膜上的表达蛋白免疫小鼠 3次 ,每次间隔 2wk,用MTB培养上清滤液蛋白 (culturefiltrateproteins,CFP)作为抗原 ,ELASA测定免疫小鼠血清特异性抗体的滴度 .为了检测融合蛋白免疫小鼠引起的细胞免疫应答 ,最后一次免疫完成后 4wk ,取一部分免疫小鼠分离脾淋巴细胞 ,体外用抗原刺激 ,MTT法检测淋巴细胞刺激反应 ,ELISA检测悬液中IFN γ水平 .另一部分免疫的BALB/c小鼠经尾静脉感染MTB毒株H37Rv ,4wk后计数脾脏细菌负荷数 .结果 :Ag85B ESAT6蛋白免疫小鼠血清特异性抗体滴度为 1∶10 0 0 ,ESAT6 Ag85B蛋白免疫小鼠血清特异性抗体滴度为 1∶5 0 0 0 .融合蛋白Ag85B ESAT6和ESAT6 Ag85B免疫组淋巴细胞刺增殖指数分别为 2 .4 0± 0 .17和 2 .6 0± 0 .2 5 ,而生理盐水组只有 0 .90± 0 .2 1;相对应的IFN γ含量分别为 (3.5 1± 0 .30 ) μg/L和 (4 .0 5± 0 .4 1) μg/L ,显著高与生理盐水对照组 (0 .5 0± 0 .2 5 ) μg/L ,P <0 .0 5 ,但不及BCG免疫组 (5 .5 5±0 .31) μg/L .与生理盐水免疫组 (细菌负荷6 .31± 0 .13)相比较 ,融合蛋白免疫的BALB/c小鼠 。
- 师长宏范雄林柏银兰薛莹张海徐志凯
- 关键词：分支杆菌结核ESAT6重组融合蛋白质类
- 分枝杆菌胞壁融合表达Ag85B-ESAT-6穿梭质粒的构建被引量：5
- 2004年
- 目的 构建E coli BCG(BacilleCalmette Guerin)穿梭载体 ,在母牛分枝杆菌细胞壁融合表达结核分枝杆菌 (MTB)的分泌蛋白Ag85B ESAT 6。方法 用聚合酶链反应 (PCR)从MTB毒株H3 7Rv基因中扩增出结核分枝杆菌 190 0 0抗原 ( 19 ss)胞壁区及其上游调控元件基因 ,克隆入E coli BCG穿梭载体 pOLYG中 ,构建表达蛋白能嵌入细胞壁中的E coli BCG穿梭载体。用间接免疫荧光染色法观察该载体携带所构建的结核分枝杆菌分泌蛋白Ag85B和ESAT 6基因在母牛分枝杆菌宿主中的融合表达。结果 经测序证实所克隆的 19 ss基因序列正确 ,所构建的E coli BCG穿梭载体 (pCW )能完成在大肠杆菌和母牛分枝杆菌细胞之间的穿梭 ,经免疫荧光检查外源基因Ag85B ESAT 6可融合表达于分枝杆菌宿主表面。 结论 本方法可成功构建能够在分枝杆菌胞壁融合表达MTB分泌蛋白Ag85B ESAT 6的E coli
- 师长宏范雄林史皆然徐志凯李元柏银兰薛莹
- 关键词：细菌抗原基因融合
