国家自然科学基金(30170835)
- 作品数：8 被引量：41H指数：4
- 相关作者：朱昌亮马磊李秀兰胡小邦孙艳更多>>
- 相关机构：南京医科大学更多>>
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- 蚊抗药性相关糜蛋白酶基因稳定转染细胞系的建立与表达鉴定被引量：2
- 2005年
- 目的建立抗药性相关糜蛋白酶基因稳定转染细胞系。方法采用PCR方法,以淡色库蚊抗药性品系cD NA文库为模板,扩增出抗药性品系高表达的糜蛋白酶基因编码区;经T/A克隆测序鉴定后,亚克隆到真核表达载体pIE13,构建重组昆虫细胞表达载体pIE13/chy,经酶切和PCR鉴定后,与带有筛选标记的pIE1neo质粒共转染蚊细胞C6/36,通过G418选择培养,建立转染细胞系;用RT PCR、Westernblotting鉴定糜蛋白酶基因的转录表达。结果成功构建了真核表达载体pIE13/chy,证明糜蛋白酶基因已转入C6/36细胞,建立了稳定转染细胞系,表达产物分子质量单位约30ku,与理论值相符。结论稳定转染细胞系的建立和基因表达为进一步研究糜蛋白酶基因与抗药性的关系奠定了基础。
- 顾燕公茂庆胡小邦孙艳马磊李秀兰朱昌亮
- 关键词：抗药性基因转染C6/36细胞
- 淡色库蚊抗溴氰菊酯品系CYP4家族新成员基因克隆及序列分析被引量：4
- 2004年
- 目的 获取淡色库蚊CYP4家族新基因。 方法 根据CYP4氨基酸保守序列设计一对简并引物 ,采用RT PCR的方法 ,从淡色库蚊抗溴氰菊酯品系四龄幼虫总RNA中扩增出与设计相符的基因片段。利用T/A克隆方法 ,将获得的基因片段克隆入 pGEM Teasy载体 ,经PCR鉴定重组成功 ,测序并进行比对。 结果 共克隆出 3 6个阳性克隆 ,将其中 9个随机挑取的阳性克隆测序及同源性分析 ,表明为CYP4家族中 9个新的cDNA序列 ,由GeneBank登录上网 ;经国际细胞色素P45 0命名委员会鉴定 ,属CYP4家族CYP4H、CYP4J亚家族。为进一步研究细胞色素P45 0的多样性及其与抗药性的关系打下基础。 结论 克隆 9个淡色库蚊基因部分序列 ,被鉴定属于CYP4家族CYP4H、CYP4J亚家族。
- 滕达李秀兰公茂庆马磊陆洵蔚孙艳朱昌亮
- 关键词：淡色库蚊细胞色素P450基因克隆
- 用SSH结合cDNA芯片分离、鉴定蚊虫抗药性相关基因
- ＜正＞ 媒介昆虫对杀虫剂产生抗性是媒介防治中的严重问题。昆虫抗药性是可遗传的复杂生物进化现象,分离抗药性和敏感性相关基因是媒介抗药性分子机制与分子诊断研究的重要基础,并可望建立媒介防治的新方法。近20年来,国外研究者采用...
- 田海生马磊沈波李秀兰朱昌亮
- 文献传递
- 用荧光半定量RT-PCR检测蚊溴氰菊酯抗性被引量：4
- 2005年
- 目的:建立蚊对菊酯类杀虫剂抗性的PCR检测方法。方法:应用荧光半定量RT鄄PCR,检测经SSH结合cDNA芯片分离鉴定的淡色库蚊对溴氰菊酯抗性相关基因NYD鄄Tr在抗性品系与敏感品系中的表达水平。结果:经荧光半定量RT鄄PCR检测,NYD鄄Tr进入指数期的循环数抗性品系早于敏感品系,抗性品系组比敏感品系组先进入指数增长期。结论:以NYD鄄Tr作为靶基因,荧光半定量RT鄄PCR可区分淡色库蚊对溴氰菊酯抗性品系与敏感品系,亦即可检测淡色库蚊溴氰菊酯抗性。
- 马磊沈波李秀兰胡小邦朱昌亮
- 关键词：淡色库蚊抗药性溴氰菊酯
- 淡色库蚊抗性相关基因——NYD-GBE基因的克隆与分析被引量：3
- 2006年
- 目的:获取淡色库蚊抗药性相关NYD-GBE基因cDNA全长序列并验证其在抗性品系和敏感品系中的表达差异。方法:根据抑制性差减杂交(SSH)结合cDNA芯片分离获得的淡色库蚊抗性相关NYD-GBE基因片段设计引物,采用快速扩增cDNA末端法(rapidamplificationofcDNAends,RACE)扩增糖原分支酶基因5′、3′端,经对位拼接获得全长序列,并用相应的软件进行生物信息学分析。结果:获得淡色库蚊NYD-GBEcDNA全长序列,开放阅读框为2070bp(GeneBank/NCBIDQ102393),编码689个氨基酸。蛋白质序列分析显示,NYD-GBE与冈比亚按蚊(Anophelesgambiae)和拟暗果蝇(Drosophilapseudoobscura)一个未知功能的蛋白同源性最高,为82%和72%,与人糖原分支酶的基因同源性次之为60%。荧光定量PCR结果显示,NYD-GBE在淡色库蚊溴氰菊酯抗性品系中的表达量是敏感品系的19.7倍。结论:获得淡色库蚊抗药性相关NYD-GBE基因全长cDNA序列,并证实其在淡色库蚊溴氰菊酯抗性品系中高表达,提示NYD-GBE与淡色库蚊溴氰菊酯抗性相关,值得进一步研究。
- 孙静钱瑾孙立新胡小邦孙艳马磊朱昌亮
- 关键词：淡色库蚊抗药性RACE克隆定量PCR
- 淡色库蚊抗药性相关新基因——视蛋白基因的克隆与分析被引量：4
- 2005年
- 目的:获取淡色库蚊抗药性相关视蛋白基因(NYD鄄OP)全长cDNA序列。方法:根据抑制性差减杂交(SSH)结合cDNA芯片分离获得的淡色库蚊抗药性相关视蛋白基因的289bp片段,设计上、下游引物,分别以cDNA文库和反转录二链产物为模板,采用快速扩增cDNA末端法(rapidamplificationofcDNAend,RACE)扩增视蛋白基因5'、3'端,经对位拼接获得全长序列,并用相应的软件进行分析。结果:获得6个淡色库蚊视蛋白基因全长序列,开放阅读框分别为1116bp(GeneBank/NCBIAY297441,AY297442)及1119bp(GeneBank/NCBIAY297443,AY297444,AY299337,AY299338),以上序列经推导分别编码371及372个氨基酸。进行蛋白质序列分析,与烟草天蛾视蛋白的同源性是77%。结论:获得6个淡色库蚊抗药性相关视蛋白基因全长cDNA序列。
- 孙艳杨明夏马磊李秀兰公茂庆胡小邦顾燕朱昌亮
- 关键词：淡色库蚊抗药性克隆
- 淡色库蚊抗药性相关胰蛋白酶基因稳定转染细胞系的建立与表达鉴定被引量：2
- 2005年
- 目的为进一步研究胰蛋白酶基因与抗药性的关系。方法采用PCR方法,以淡色库蚊抗性品系cDNA文库为模板,扩增出抗药性品系高表达的胰蛋白酶(trypsin)基因编码区。T/A克隆测序鉴定后,亚克隆到昆虫细胞表达载体pIE13,构建重组昆虫细胞表达载体pIE13/try。经酶切和PCR鉴定后,与带有筛选标记的pIE1neo质粒共转染蚊虫细胞C6/36,通过G418选择培养,建立稳定转染细胞。用RTPCR、Westernblotting鉴定胰蛋白酶基因的转录表达。结果酶切和PCR鉴定表明,成功构建昆虫细胞表达载体pIE13/try;证实胰蛋白酶基因已转入C6/36细胞,并建立稳定转染细胞系,成功地表达目的基因。结论稳定转染细胞系的建立和基因表达为进一步研究胰蛋白酶与抗药性的关系提供了良好的实验基础。
- 公茂庆顾燕胡小邦孙艳马磊李秀兰朱昌亮
- 关键词：抗药性基因转染C6/36细胞
- 淡色库蚊β-肌动蛋白基因克隆与序列分析被引量：12
- 2003年
- 目的 获取淡色库蚊 β-肌动蛋白全长基因。 方法 采用 RACE法筛选淡色库蚊溴氰菊酯抗性品系 c DNA表达文库 ,获得 β-肌动蛋白基因的 5′和 3′RACE序列 ,然后通过 T/ A克隆插入 p GEM- T质粒载体 ,经过测序、拼接获取全长序列。用 BL ASTp软件将该基因推导的氨基酸序列与蛋白质公共数据库 Swissprot比对、分析。 结果 获得淡色库蚊 β-肌动蛋白基因全长序列 ,总长度为 12 90 bp,开放阅读框为 1132 bp,编码 377个氨基酸 (Gen Bank/ NCBIAY10 0 0 0 5 )。推导的氨基酸序列与公共数据库比对 ,发现与冈比亚按蚊和黑腹果蝇的 β-肌动蛋白的同源性均为 91%。蛋白质的理论分子质量为 4 1.7ku,等电点 (PI)为 5 .4。 结论 获得了淡色库蚊 β-肌动蛋白基因全长序列 ,为蚊虫分子生物学的进一步研究奠定了基础。
- 胡莺沈波杨明夏马磊李秀兰田海生朱昌亮
- 关键词：淡色库蚊Β-肌动蛋白克隆
