国家重点基础研究发展计划(2006CB943703)
- 作品数：10 被引量：23H指数：3
- 相关作者：关云谦张愚朱宛宛陈凌左晓虹更多>>
- 相关机构：首都医科大学宣武医院首都师范大学国家人类基因组北方研究中心更多>>
- 发文基金：国家重点基础研究发展计划国家自然科学基金国家高技术研究发展计划更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学更多>>
- 含GDNF基因的慢病毒载体的构建和其在人胚胎神经干细胞中的表达被引量：4
- 2008年
- 利用含胶质源性神经营养因子(Glial cell derived neurotrophic factor,GDNF)基因的慢病毒载体转染了人胚胎来源的神经干细胞,探讨了转染后GDNF在神经干细胞中的体外表达水平及其影响因素。首先GDNF基因被克隆入慢病毒载体,通过瞬时转染法包装出病毒上清,经滴度鉴定后分别按拷贝数为1、2.5、5、10转染神经干细胞。转染后细胞经过潮霉素筛选得到均一表达GDNF的神经干细胞体系。其后分别利用酶联免疫吸附(ELISA)方法和Real-time PCR方法测定不同转染组细胞在不同时间点GDNF的蛋白分泌水平和基因表达水平。实验中构建了表达GDNF基因的慢病毒载体,包装出的病毒上清在体外培养条件下成功转染了神经干细胞,经潮霉素筛选可以得到均一的持续表达分泌GDNF的人胚胎皮层神经干细胞体系。实验结果表明转染拷贝数可以影响GDNF的分泌水平,相同条件下转染拷贝数越高,GDNF分泌量越多,其基因表达水平越高。因此,含GDNF的慢病毒载体可以成功转染人胚胎来源的神经干细胞,使其持续表达GDNF,转染过程中可以通过拷贝数在一定水平上控制GDNF的蛋白分泌水平和基因表达水平。
- 王淑艳任萍谢淑朱宛宛王暘关云谦张愚
- 关键词：胶质源性神经营养因子神经干细胞慢病毒载体
- 细胞外信号调节激酶在小鼠神经干细胞增殖中的作用(英文)被引量：2
- 2008年
- 本文旨在探讨细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase1/2,ERK1/2)对小鼠神经干细胞增殖的影响。分离E14.5小鼠皮层神经干细胞,通过Western blot检测神经干细胞增殖过程中磷酸化ERK1/2的表达情况,以及不同浓度PD98059处理对神经干细胞ERK1/2磷酸化及神经球形成的影响,并用CCK-8法检测PD98059对神经干细胞增殖的影响。结果显示:ERK1/2在体外培养的神经干细胞增殖过程中被激活;PD98059显著抑制ERK1/2磷酸化及神经干细胞的成球率,且存在剂量效应依赖关系;加入PD98059后神经干细胞的生长被抑制。以上结果表明,ERK1/2在小鼠神经干细胞增殖中具有重要的作用,阻断ERK1/2信号通路后可抑制神经干细胞的增殖。
- 黄欣赵彤赵华熊雷刘朝晖吴丽颖朱玲玲范明
- 关键词：神经干细胞细胞外信号调节激酶PD98059增殖
- 小鼠纹状体时钟基因表达的生后发育被引量：4
- 2009年
- 目的研究小鼠纹状体中时钟基因表达的生后发育。方法选新生早期（P3）、断奶前期（P14）和成年（P60）小鼠，光照1h[01Hour-After-Light-On（HALO）=09：00]起取纹状体，连续24h取材，取材时间间隔6h。实时定量RT—PCR检测时钟基因Bmall，Clock，Cryl，Perl和Rev-erbamRNA水平。结果P3组中，5种时钟基因表达均无明显波动；P14组仅有Rev-erb αmRNA表达随时间变化（P=0．027），表达高峰在19-01HALO；而P60组，各基因表达均表现明显波动[Bmall（P=0．004）、Clock（P=0．004）、Perl（P=0．004）、Rev—erbcL（P=0．004）]，Bmall，Clock和Cryl的高峰在01HALO，Perl和Rev—erbct分别在13HALO和07HALO。此外每种基因的总体表达水平出生后也呈动态变化，Bmall，Clock，Perl和Rev—erb表达丰度随发育而增加，P3组〈P14〈P60；Cryl则在P3和P60表达相近，P14表达较低。P3和P14组Bmall、Clock分别为1．74和1．16，表明发育早期Bmall的表达高于Clock。结论纹状体时钟基因在出生后逐渐发育，最终形成成年小鼠中调节纹状体生物节律的、功能完善的网络。
- 左晓虹蔡彦宁李宁刘姝张燕莉陈彪
- 关键词：昼夜节律纹状体
- 大鼠脑梗死后48小时移植入胚胎干细胞的存活和分化被引量：1
- 2010年
- 目的观察小鼠胚胎干细胞，在大鼠脑梗死发生48h后移植入梗死核心区，是否能够存活并且分化为神经元和胶质细胞。方法小鼠胚胎干细胞去除滋养层后培养，线栓法制作大鼠大脑中动脉堵塞脑梗死模型，成模48h后将胚胎干细胞移植入梗死核心区。移植21d后切片观察。结果植入的胚胎干细胞可在梗死区的边缘存活，并且大量分化成为神经元和胶质细胞，植入细胞所分化出的神经细胞中，表达NeuN和胶质纤维酸性蛋白（GFAP）的神经元和胶质细胞的比例分别达到（83．0±3．2）％和（22．0±3．6）％。结论在脑梗死后48h于核心区植入胚胎干细胞可能成为新的移植方式。
- 陈凌王淑燕赵春松陈立华张愚关云谦
- 关键词：胚胎干细胞脑梗死分化
- 小鼠胚胎干细胞移植后两种示踪方法的比较
- 2010年
- 目的观察小鼠胚胎干细胞(ES)移植入大鼠脑内后绿色荧光蛋白(GFP)质粒和Thy-1抗体在指示细胞及细胞分化方面的特点。方法标记方法一:将p-EGFP-N1质粒转入ES细胞,连续10代抗生素筛选表达GFP的GFP-ES,并将GFP-ES移植入活体大鼠脑内。取材后冰冻切片,在荧光显微镜下观察切片上的绿色荧光。标记方法二:直接移植胚胎干细胞后取材,用特异性抗小鼠Thy-1抗体作移植细胞的免疫组织化学染色,荧光显微镜下观察。另外,两种标记方法均做神经元和胶质细胞的特异抗体神经细胞核抗体(NeuN)和胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)的免疫组织化学染色,观察是否与GFP或Thy-1抗体双标记,以此判定细胞分化情况。结果 GFP质粒转化后的ES细胞团和单细胞均表达亮绿色的GFP,转化效率为30%;移植21d后,大鼠脑内存活的移植细胞仍表达GFP,但不能和NeuN、GFAP的染色双标记。大量Thy-1阳性的植入细胞和NeuN、GFAP双标记。结论 GFP质粒标记胚胎干细胞后移植可以较好地显示移植细胞,但不能观察细胞分化;而Thy-1抗体不仅在显示移植细胞上有较好的效果,还可以准确地标记分化细胞。
- 关云谦谢淑孙静敏邹春林陈凌张愚
- 关键词：绿色荧光蛋白胚胎干细胞分化
- 帕金森病患者外周血白细胞中时钟基因Bmal1和Bmal2的表达被引量：2
- 2011年
- 目的研究帕金森病患者时钟基因的表达，探讨帕金森病的分子时钟机制。方法实验对象为17例帕金森病（PD）患者（9例男性，8例女性）和16例正常人对照（9例男性，7例女性），分别在夜间21：00、00：00、06：00和09：00四个时间点取血样，用实时定量RT—PCR检测时钟基因Bmal1和Bmal2的mRNA表达水平。结果PD患者中，Bmal1在21：00、00：00、06：00的表达水平与正常对照差异具有显著性：21：00[（22．17±4．09），（51．14±8．31），P=0．003]；00：00[（30．30±5．45），（100．00±24．71），P=0．008]；06：00[（19．02±3．33），（65．61±14．11），P=0．002]。Bmal2在21：00、00：00的表达水平与正常对照差异有显著性：21：00[（48．09±7．40），（84．96±9．34），P=0．005]；00：00[（65．85±7．88），（100．00±11．78），P=0．025]。结论PD患者的周围分子时钟发生了改变。PD患者时钟基因Bmal1和Bmal2在外周血的相对表达水平明显减低，为疾病监控和研究疾病对药物的反应性提供分子基础。
- 林庆玲蔡彦宁袁艳鹏左晓虹陈彪
- 关键词：BMAL1昼夜节律白细胞帕金森病
- 免疫磁珠分选降低分化体系中胚胎干细胞的比例被引量：1
- 2009年
- 研究目的:采用免疫磁珠分选系统(magnetic activated cell sorting,MACS)分离去除小鼠胚胎干细胞(murine embryonic stem cells,mES)向神经细胞分化时培养体系中的ES细胞,即对分化细胞进行纯化,以期减少移植致瘤性。方法:诱导mES细胞向神经细胞分化,取分化第四期的细胞,胰酶消化制成单细胞悬液,用mES特异性表面抗原SSEA-1(special stage embryonic antigen-1)单抗标记,间接免疫磁珠分选系统分离去除SSEA-1阳性细胞,流式细胞仪检测分选前后细胞中mES细胞的比例,台盼蓝染色检测分选前后细胞存活率。结果:经MACS分选后的阴性细胞中的SSEA-1阳性率可以由分选前的(7.19±1.36)%下降到(1.34±0.80)%,结果具有显著性差异;分选后的细胞存活率仍为92%左右,与分选前存活率无明显变化。结论用SSEA-1作为表面标志,用MACS方法能有效地去除胚胎干细胞分化细胞中残存的胚胎干细胞,得到高纯度的分化细胞,并且细胞存活率不受影响,为下一步进行移植实验奠定基础。
- 朱宛宛杜庆安王淑艳徐艳玲关云谦张愚
- 关键词：免疫磁珠分选胚胎干细胞神经前体细胞分化
- 神经干细胞的自发永生化
- 2010年
- 目的 观察培养达24个月的神经干细胞（NSC）是否会发生永生化和恶变.方法 培养流产胎儿皮层来源的NSC.对培养超过24个月的NSC,分析其核型,检测其自我更新、增殖、衰老以及移植后的致瘤性等.检测其Bmi-1-p16INK4a/p14ARF基因通路的改变.结果 体外培养超过24个月的NSC自我更新旺盛,克隆形成率（14.89±4.75）%,显著高于正常培养8周NSC的（8.04±2.07）%;生长速度快,表现为传代1周后的新生神经球的直径为（85.98±30.24）μm,显著高于体外培养8周NSC的（15.97±9.97）μm.此外,培养超过24个月的NSC衰老细胞为（5.96±2.81）%,远低于正常培养8周NSC的（78.14±8.99）%;而且染色体数目异常,这些结果可以确定其发生了永生化.裸鼠移植未发现致瘤性,所以该细胞未发生恶变.此2株细胞中Bmi-1、p16INK4a、p14ARF基因均缺失.结论 体外长期培养的人类皮层神经干细胞能够自发永生化,表现为不进入衰老状态并不断增殖.其增殖不依赖于Bmi-1基因,而其不衰老状态可能和p16INK4a、p14ARF基因缺失有关.
- 陈凌关云谦王淑燕赵春松陈立华张愚
- 关键词：神经干细胞永生化衰老
- Effect of basic fibroblast growth factor on the proliferation, migration and phenotypic modulation of airway smooth muscle cells被引量：9
- 2008年
- 背景：增长，细胞移行和航线平滑肌房间(ASMC ) 的表型的调整是航线在气喘改变的重要特征。在肺调整 ASMC 增长，移植和表型的调整的精确细胞、分子的机制仍然保持未知。基本成纤维细胞生长因素(bFGF ) ，为许多房间的一个高度特定的趋化性、致有丝分裂的因素打字，看起来涉及航线改变的发展。我们的学习估计了 bFGF 是否直接刺激增长，迁居和 ASMC 的表型的调整。方法：汇合并且生长逮捕了人的 ASMC 与人的 recombinant FGF 被对待。增长被 BrdU 加入并且房间数测量。移植用 Boyden 房间仪器被检验。平滑肌(sm ) 的表情 -alpha-actin 和 sm 肌浆球蛋白重链(MHC ) 对碘氧基苯甲醚 1 被 RT-PCR 和西方的污点分析决定。结果：当增加了 ASMC 时， hrbFGF (10 ng/ml ) 关于控制作为与在 ASMC 移植的控制和重要增加相比由 ASMC 在 BrdU 举起和房间数字导致了重要增加，这被发现。在与 hrbFGF 被刺激的 ASMC 的 sm-alpha-actin 和 sm-MHC 的 mRNA 和蛋白质表情关于控制减少了。结论：然而，看来， bFGF 能直接刺激 ASMC 的增长和移植房间的有收缩力的显型的表达式减少了。
- ZOU HuiNIE Xiu-hongZHANG YiHU MuZHANG Yu Alex
- 关键词：哮喘成纤维细胞
- 食蟹猴胚胎干细胞的培养及向神经细胞诱导分化
- 2009年
- 目的建立食蟹猴胚胎干细胞系体外培养体系,并诱导其向神经细胞分化,为在体移植实验奠定基础。方法用小鼠胚胎成纤维细胞作为饲养层,长期培养食蟹猴胚胎干细胞。在无血清培养基中添加小鼠重组Noggin的方式诱导其向神经细胞分化,并对分化各阶段细胞进行免疫组化染色检测分化效果。结果食蟹猴胚胎干细胞在饲养层上成克隆样生长,可以长期扩增超过20代并保持胚胎干细胞的特性。诱导向神经细胞分化约14 d,即可形成呈玫瑰花环样的神经前体细胞结构,可见大量Nestin阳性细胞,及部分Tu j-1阳性细胞;分化约21 d时,可见大量Nes-tin阳性细胞以及大量Tu j-1阳性细胞;分化超过35 d,可见GFAP阳性细胞,而Tu j-1阳性细胞减少。结论成功建立食蟹猴胚胎干细胞的培养体系,在此基础上诱导其分化可获得大量神经前体细胞,尤其是早期神经细胞。
- 朱宛宛吴迪李宁邹春林徐艳玲关云谦张愚
- 关键词：食蟹猴胚胎干细胞细胞培养神经分化
