黑龙江省自然科学基金(C201103)
- 作品数：14 被引量：19H指数：2
- 相关作者：李士泽杨焕民孟宇李昌盛李静辉更多>>
- 相关机构：黑龙江八一农垦大学弗吉尼亚理工大学更多>>
- 发文基金：黑龙江省自然科学基金引进国际先进农业科技计划国家自然科学基金更多>>
- 相关领域：生物学农业科学更多>>
- 冷应激条件下猪睾丸细胞中RNA结合基序蛋白3过表达对Caspase 3表达的影响被引量：1
- 2016年
- 目的:探讨冷应激(32℃)条件下,猪睾丸(ST)细胞系中RNA结合基序蛋白3(RBM3)过表达时凋亡蛋白半胱天冬酶3(Caspase 3)表达量变化情况。方法:利用本实验室成功构建的携带绿色荧光蛋白(GFP)的RBM3过表达慢病毒载体pLenti6/V5-GW/EmGFP-RBM3和空病毒载体pLenti6/V5-GW/EmGFP-DEST分别感染ST细胞,作为过表达病毒(OEV)组和空载体病毒(EVV)组,此外还设立野生型细胞(WTC)组作对照,利用实时荧光定量RCR(qPCR)法和Western blot分析法检测各组中RBM3 mRNA和蛋白的表达情况。然后对各组细胞进行37℃以及32℃(2 h、4 h,8 h)的冷应激处理,利用酶联免疫吸附实验(ELISA)法检测各组Caspase 3表达量的变化。结果:OEV组RBM3基因和蛋白相对表达量高于EVV组和WTC组。在37℃以及32℃冷应激实验(2 h、4 h,8 h)中,OEV组Caspase 3表达量显著低于EVV组和WTC组。结论:冷应激ST细胞中RBM3过表达能够显著地降低Caspase 3的表达程度,为RBM3基因具有抵抗低温诱导ST细胞凋亡作用提供实验依据。
- 李云龙李俭李昌盛李静辉孟宇杨焕民李士泽
- 关键词：冷应激过表达半胱天冬酶3
- CIRP对冷应激小鼠血清生化指标、相关细胞免疫因子及能量代谢的影响被引量：6
- 2016年
- 将45只6周龄体质量(18±2)g SPF级雄性SD小鼠随机分为5组(n=5),常温对照组5只(A组);低温对照组冷刺激4、8h各5只(B组);冷诱导RNA结合蛋白(cold-inducible RNA binding protein,CIRP)过表达组冷刺激4、8h各5只(C组),注射CIRP过表达慢病毒液0.1mL;CIRP干扰组冷刺激4、8h各5只(D组),注射CIRP干扰病毒液0.1mL;阴性对照组冷刺激4、8h各5只(E组),注射空载体病毒液0.1mL。A组置于常温(21±0.1)℃条件下饲养,后4组置于低温(4±0.1)℃环境饲养,分别在4h及8h后通过摘除眼球的方法采取血液。采用ELISA法检测血清中IL-1、IL-2、IL-6、GSH-PX、SOD、T-AOC、MDA、丙酮酸、PFK-1、LDH的含量。结果显示:(1)冷应激处理后,小鼠血清中相关细胞因子水平出现明显变化,人为的致使CIRP在小鼠体内出现不同的表达对血清中相关细胞因子的影响差异显著(P<0.05);(2)冷应激处理后,小鼠血清中氧化还原指标GSH-PX、SOD、T-AOC、MDA变化非常明显,人为的致使CIRP在小鼠体内出现不同的表达对血清中相关氧化还原指标的影响差异极显著(P<0.01);(3)冷应激处理后,血清当中能量代谢相关指标无明显变化,人为的致使CIRP在小鼠体内出现不同的表达对血清中相关能量代谢指标的影响差异不显著(P>0.05)。结果表明:在不影响动物机体能量代谢的情况下,CIRP可以有效地抑制细胞内氧自由基的生成,从而提高小鼠抗氧化能力,以及调节动物机体的相关免疫因子,对小鼠抵抗低温应激起到积极地保护作用。
- 李静辉张雪孟宇李昌盛计红杨焕民李士泽
- 关键词：小鼠
- 氧化应激反应下O-GlcNAC对骨骼肌代谢的影响
- 2015年
- 氧化应激是机体内一种不可避免的状态。正常情况下,机体内会有一系列的适应机制保护细胞免受损伤,但多种有害刺激可以打破氧化应激的平衡状态,进而对细胞信号转导系统产生影响,并导致核酸、蛋白质和脂质等大分子物质的损伤。蛋白质翻译后修饰是调控蛋白质功能及影响细胞行为的重要方式,而氧化应激会直接影响蛋白质的翻译后修饰。O-GlcNAc糖基化修饰作为一种特殊的蛋白质翻译后修饰形式,动态调节细胞信号传导途径中许多酶的功能,并且在骨骼肌中扮演着重要的角色。鉴于O-GlcNAc糖基化修饰、骨骼肌二者与氧化应激有着密切的联系。本文将重点阐述氧化应激下,O-GlcNAc糖基化修饰对骨骼肌代谢的影响。
- 张雪SHI Hao杨玉英李云龙李昌盛杨焕民计红李士泽
- 关键词：氧化应激O-GLCNAC骨骼肌
- RBM3重组慢病毒载体的构建、包装和鉴定被引量：1
- 2014年
- 构建含有冷休克蛋白RNA结合基序蛋白3(RBM3)基因的慢病毒表达载体,产毒感染ST细胞,以评价重组慢病毒载体提高RBM3蛋白表达的效果.应用分子生物学技术提取仔猪脾脏组织的总RNA,通过反转录方法扩增RBM3基因,将其连入慢病毒载体Plenti6/v5-DEST中,在感受态细胞DH5α中扩增培养,并进行RBM3基因的测序鉴定,将重组的慢病毒质粒转染293T细胞,收获病毒液,感染293T细胞并提取细胞RNA,用逆转录PCR方法检测RBM3 mRNA在感染病毒的293T细胞中的表达,用含有慢病毒空载体pLenti6/V5-DEST的病毒液、含有重组慢病毒载体pLenti6/V5-RBM3的病毒液和无菌去离子水分别感染ST细胞后通过Western blot方法检测RBM3蛋白在感染病毒的ST细胞中的表达.结果表明:构建的慢病毒载体Plenti6/v5-RBM3经测序分析证实基因序列正确.包装后的慢病毒滴度为107 PFU/mL.逆转录PCR方法检测到感染病毒的293T细胞中,RBM3基因在转录水平上有表达,Western blot方法检测到感染病毒的ST细胞中,空载体组与空白对照组相比,RBM3蛋白表达量接近相同(分别为0.312±0.022和0.282±0.028);过表达组与空白对照组相比,RBM3蛋白表达量(0.568±0.045)显著增加(P<0.05),RBM3蛋白在翻译水平有表达.因此,本研究构建的携带RBM3基因的重组慢病毒能够感染ST细胞,并使其RBM3蛋白表达量增加.
- 李俭杨玉英李玉恒郭景茹计红郭丽李鹏杨焕民李士泽
- 关键词：冷休克蛋白慢病毒载体WESTERNBLOT
- 谷氨酰胺和L-肉碱对低温应激下AA肉仔鸡生产性能的影响
- 2013年
- 研究旨在从生产性能方面研究谷氨酰胺和L-肉碱在促进动物生长,减缓低温应激的影响,为生产实践应用抗应激添加剂提供理论依据和有益参考。采用L16(45)正交试验设计,将480只1日龄AA肉仔鸡,随机分为16组,每组3个重复,每个重复10羽肉仔鸡。谷氨酰胺添加水平分别为0%、0.4%、0.6%、0.8%,L-肉碱添加水平分别为0、50、75、100 mg.kg-1。预饲一周,试验期2周。低温条件下,在AA肉仔鸡基础日粮中联合添加谷氨酰胺和L-肉碱,显著提高了冷暴露AA肉仔鸡生产性能(p<0.05);谷氨酰胺为0.8%,L-肉碱的添加量为75 mg.kg-1对低温环境下肉仔鸡的作用效果最好。
- 王雷纪丽丽李俭申凤华刘丛计红杨焕民李士泽
- 关键词：谷氨酰胺L-肉碱
- 冷诱导RNA结合蛋白(CIRP)过表达载体的构建及鉴定被引量：1
- 2015年
- 为构建携带冷诱导RNA结合蛋白(Cold inducible RNA-binding protein,CIRP)的过表达载体,首先从4℃条件下冷处理8 h的SD大鼠睾丸组织中获得CIRP基因的c DNA序列,然后扩增CIRP基因的编码区,将其克隆到真核表达载体p Lenti6/V5中,酶切鉴定并测序.将克隆成功的质粒转染HEK293T细胞,用Western blot检测CIRP的表达水平.成功扩增CIRP编码区,并将其克隆至载体p Lenti6/V5中;当将CIRP过表达载体转染HEK293T细胞后,Western blot检测结果显示CIRP蛋白表达水平明显增加(P<0.01).本研究成功构建了CIRP过表达载体,为进一步研究CIRP的作用机制提供了基础工具.
- 李静辉孟宇李玉恒李昌盛杨焕民李士泽
- 关键词：过表达质粒冷应激
- 应用2-DE技术对冷应激前后雏鸡血清蛋白质表达谱的差异分析被引量：1
- 2015年
- 为了比较冷应激前后雏鸡血清蛋白质组的差异,试验采取冷应激处理前后的雏鸡血清,经双向电泳(two-dimensional electrophoresis,2-DE),考马斯亮蓝染色后用PDQuest凝胶图像分析软件测定分析了雏鸡冷应激前后的血清蛋白质组。结果表明:冷应激前后雏鸡血清蛋白质组具有明显的差异表达;成功建立了雏鸡血清蛋白质双向电泳技术。
- 贺军李士泽张雪李云龙李静辉孟宇
- 关键词：冷应激双向电泳雏鸡血清蛋白质表达谱
- 基于CIRP基因有效干扰靶点的筛选
- 2015年
- 为了研究冷诱导RNA结合蛋白(CIRP)更深入的功能及意义,试验通过Lipo FiterTM将黑龙江八一农垦大学动物生理生化实验室之前已构建好的5组RNA干扰重组载体及空载体分别瞬时转染到大鼠肝细胞中,提取细胞RNA经反转录后进行荧光定量PCR试验,获得各组干扰载体对CIRP基因干扰后CIRP基因mRNA的相对表达量,确定效果最佳的干扰靶点。结果表明:在5组干扰试验组CIRP基因mRNA的表达量中,264组与空白对照组的表达量差异显著(P<0.05),并且干扰效率达到70%以上;阴性对照组(空载体组)与空白对照组的表达量基本相同,差异不显著(P>0.05)。说明试验成功筛选出有效干扰靶点。
- 孟宇李静辉张雪李云龙贺军李士泽
- 关键词：冷休克蛋白RNA干扰荧光定量冷应激
- 经典碱裂解法质粒大量提取方法的改良被引量：5
- 2012年
- 利用滤膜过滤技术对经典碱裂解法进行改良,并将改良后的提取效果与经典碱裂解法和试剂盒法进行比较。结果表明,改良法提取的质粒DNA浓度显著高于经典碱裂解法和试剂盒法,并且质粒纯度与试剂盒法相近。改良方法适用于实验室的应用与推广。
- 孟宇李静孙智峰李玉恒李昌盛林增李士泽
- 关键词：碱裂解法质粒DNA
- Wistar大鼠热休克蛋白70基因重组腺病毒质粒的构建及病毒制备
- 2012年
- 目的构建Wistar大鼠热休克蛋白(Heat shock protein 70,HSP70)基因重组腺病毒质粒,并制备重组腺病毒。方法利用RT-PCR技术从Wistar大鼠脾脏组织中扩增HSP70基因序列,并克隆至pMD18-T载体中,测序鉴定后,将克隆的HSP70基因编码阅读框亚克隆至穿梭载体pShuttle-CMV中,并利用Ⅰ-CeuⅠ与Ⅰ-SceⅠ将重组穿梭质粒上的HSP70基因的表达框切下,连接到携带腺病毒骨架载体pAdxsi上。重组腺病毒质粒经PacⅠ酶切线性化后,转染至293(R)细胞进行病毒的包装,获得重组腺病毒pAd-CMV-HSP70,收集病毒上清,感染BRL细胞,Western blot检测BRL细胞中HSP70的表达。病毒颗粒经氯化铯密度梯度离心纯化后,检测重组腺病毒纯度、颗粒滴度及感染性滴度。结果克隆质粒、穿梭质粒经PCR及酶切鉴定,均可见2 269 bp的目的基因条带,测序结果与GenBank登录的序列一致;XhoⅠ酶切结果显示,HSP70基因已正确克隆至腺病毒质粒中;重组腺病毒感染BRL细胞后,细胞中HSP70的表达量显著升高(P<0.01);重组腺病毒纯化后纯度为1.29,颗粒滴度为5.31×1012VP/ml,感染性滴度达1×1011pfu/ml。结论已成功构建Wistar大鼠HSP70基因重组腺病毒质粒,并制备出高滴度的重组腺病毒颗粒,为进一步研究HSP70的生物学活性及作用机制奠定了基础。
- 郭景茹臧琳郭爽王建发计红李士泽薛琳琳杨焕民
- 关键词：HSP70基因重组腺病毒基因表达
