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锌指蛋白A20基因对内皮细胞缺氧损伤的保护作用被引量：3: 2008年; 目的:探讨外源性锌指蛋白家族中A20基因对缺氧诱导内皮细胞凋亡的影响。方法:①培养原代人脐静脉内皮细胞,将细胞分组建立缺氧模型;②采用DOTAP脂质体介导pcDNA3.1EHA20质粒转染培养的内皮细胞,经G418筛选,免疫荧光检测A20基因的表达;③TUNEL原位末端标记法检测转染前后缺氧诱导内皮细胞凋亡情况。结果:A20基因在内皮细胞中得到有效表达,正常对照组及转染A20基因组人脐静脉内皮细胞凋亡为(4±1)%,缺氧培养24h后对照组与转染A20基因组凋亡分别为(18±1)%、(8±1)%,两者相差有显著性意义(P<0.05)。结论:A20基因能够显著抑制缺氧诱导的内皮细胞凋亡,可能在缺氧所致内皮细胞损伤中具有保护作用。; 张剑凯朱楚洪糜建红应大君; 关键词：A20基因内皮细胞缺氧凋亡

人血管平滑肌细胞种植构建工程生物血管的实验研究被引量：1: 2005年; 了解猪血管去细胞后平滑肌细胞种植情况,为猪血管用于血管组织工程提供资料。取猪颈动脉,生物酶预处理猪血管,在自行设计制作的新型动力性生物反应器中,用原代培养的人平滑肌细胞种植在去细胞血管基质材料内,HE染色及银染检测平滑肌细胞种植效果。结果表明生物酶预处理血管后,HE染色及银染检测可见血管腔平滑肌细胞形态正常,沿血管长轴分布,提示经生物酶预处理的猪血管人平滑肌细胞能成功种植,可望构建实用的组织工程血管。; 朱楚洪应大君糜建红; 关键词：平滑肌细胞血管平滑肌血管组织工程细胞种植组织工程血管酶预处理

人工锌指蛋白真核表达载体的构建及表达被引量：2: 2008年; 目的构建人工锌指蛋白ZFP基因的真核表达载体,检测其在真核细胞的表达情况,从而探讨人工锌指蛋白作为人工转录因子DNA结合域的可能性。方法全基因合成人工锌指蛋白(putative zinc finger protein,ZFP)的核酸序列并克隆入pEGFP-N1及pIRES2-EGFP真核表达载体中,构建重组质粒pEGFP-N1/ZFP及pIRES2-EGFP/ZFP-Flag,通过酶切、菌落PCR及测序来鉴定重组载体的正确性。脂质体DOTAP体外转染重组质粒于COS-7细胞中,用荧光显微镜、RT-PCR、Western blot方法鉴定ZFP在该细胞中的表达。结果正确构建了pEGFP-N1/ZFP、pIRES2-EGFP/ZFP-flag重组表达质粒,并且在COS-7细胞中成功进行了人工锌指蛋白ZFP的表达。结论采用生物信息学手段获得的假定的锌指蛋白基因序列可以在真核细胞内正常表达。; 魏勇应大君朱楚洪侯春丽崔晓萍; 关键词：真核表达载体 EGFP COS-7细胞

绿色荧光蛋白转基因小鼠骨髓间充质干细胞向内皮细胞定向分化的能力被引量：7: 2005年; 目的:研究绿色荧光蛋白转基因小鼠骨髓间充质干细胞(mesenchymastemcells,MSCs)体外扩增及其向内皮细胞定向分化能力,为血管组织工程在体研究提供实验依据。方法:实验于2003-10/2004-10在第三军医大学基础部解剖学教研室完成。无菌条件下采集绿色荧光蛋白转基因小鼠骨髓,用直接贴壁法获得小鼠MSCs,然后以血管内皮生长因子(vascularendothelialgrowthfactor,VEGF)进行诱导分化,最后对扩增的细胞特征进行八因子(Willbrandfactor,vWF)免疫荧光鉴定观察。结果:MSCs每扩增一代,细胞数量增加4～8倍,7.0×103个原代MSCs体外扩增3代即获得1.4×108个细胞。在70%～80%融合时呈现“铺路石”样形态,说明绿色荧光蛋白转基因小鼠MSCs在体外的培养扩增条件与一般小鼠相同。添加VEGF诱导2周后,以免疫荧光法检测细胞的vWF的表达发现,诱导组的vWF呈阳性表达,对照组vWF表达呈阴性。结论:绿色荧光蛋白转基因小鼠MSCs在体外的培养扩增能力强,在VEGF作用下可以向内皮细胞转化。; 李立应大君朱楚洪糜建红王廷华羊惠君; 关键词：骨髓细胞发光蛋白质类内皮

核因子NF-κB p65亚基TAD的克隆及表达被引量：2: 2007年; 目的获得NF-κB p65亚基转录激活区域(transcription activation dom ain,TAD),构建真核表达载体并在内皮细胞中检测其表达。方法培养人脐静脉内皮细胞,提取总RNA,经RT-PCR得到p65 TAD基因片段,测序正确后插入带有绿色荧光蛋白的真核表达载体pEGFP-N1,构建表达载体pEGFP-N1-p65 TAD,然后转染内皮细胞,荧光显微镜下观察表达情况,同时用W estern b lot分析蛋白的表达。结果有效地扩增了p65 TAD 783 bp的目的基因片段。酶切结果表明所构建的含p65 TAD基因的质粒与设计相同。p65 TAD在脐静脉内皮细胞中得到了高效的表达。结论成功地构建了p65 TAD的真核表达载体并实现了在内皮细胞中的高效表达。; 侯春丽应大君魏勇; 关键词：核转录因子NF-ΚB 克隆

人工锌指蛋白(ZFP)的设计及原核表达分析被引量：2: 2008年; 本实验通过生物信息学手段人工设计了与A20基因启动子区特定靶序列特异作用的锌指蛋白结合域。首先对A20基因启动子进行了结构及功能分析,把经过分析获取的A20启动子区的目标序列提交Scrips研究院的ZF Tools在线服务器,经序列比较,成功获取了A20启动子区特定的18bp靶序列及与这一靶序列特异性作用的锌指蛋白的氨基酸序列。进一步利用生物信息学手段对获取的锌指蛋白进行了序列特征分析及结构模建。把锌指蛋白的DNA优化序列重组于原核表达载体pTYB11上,并成功进行了原核表达。研究表明,利用生物信息学手段,人工设计特定的锌指蛋白可行,为进一步设计完整的人工转录因子,进而干预A20基因的表达奠定了基础。; 魏勇应大君侯春丽朱楚洪崔晓萍邢艳郭洪峰; 关键词：锌指蛋白启动子生物信息学同源模建原核表达

外源性A20基因对缺氧诱导的内皮细胞E-选择素表达的影响被引量：4: 2007年; 目的:探讨外源性A20基因在缺氧培养条件下对内皮细胞E-选择素表达的影响。方法:培养原代人脐静脉内皮细胞,将细胞分组建立缺氧模型。采用脂质体转染法将质粒pcDNA3.1EHA20转染培养的内皮细胞,筛选出抗G418的阳性克隆,经免疫荧光鉴定A20表达。采用免疫组化和原位杂交的方法检测内皮细胞E-选择素的表达。结果:缺氧能诱导人内皮细胞E-选择素的高表达。外源性A20基因抑制80%以上由缺氧诱导的内皮细胞E-选择素的表达。结论:外源性A20基因能够显著抑制缺氧诱导的人内皮细胞的活化,有效抑制E-选择素的表达。; 侯春丽朱楚洪应大君; 关键词：细胞低氧内皮细胞 E-选择素

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国家自然科学基金(30472027)