国家教育部博士点基金(20050698043)
- 作品数：12 被引量：57H指数：7
- 相关作者：贺西京李浩鹏袁普卫王栋王斌更多>>
- 相关机构：西安交通大学医学院第二附属医院陕西中医药大学附属医院广州医学院第二附属医院更多>>
- 发文基金：国家教育部博士点基金吴阶平医学基金陕西省科技攻关计划更多>>
- 相关领域：医药卫生更多>>
- 三种纯化方法体外培养人胚嗅球嗅鞘细胞的比较被引量：4
- 2008年
- 目的：嗅鞘细胞纯化培养方法有免疫亲和吸附法、免疫磁珠法、化学药物法、差速贴壁法、无血清饥饿法等,但均存在缺陷。比较3种纯化方法原代培养人胚嗅球嗅鞘细胞的纯度,寻求简单实用的高纯度人胚嗅球嗅鞘细胞的体外培养方法。方法：实验于2007-08/12在西安交通大学口腔医院医学实验中心进行。选用流产胚胎标本24份,胎龄4-6月,由西安交通大学第二医院和陕西省妇幼保健院产科提供。实验经产妇及家属同意,并经医院伦理委员会的批准。实验方法：取胚胎嗅球分离培养嗅鞘细胞,制成单细胞悬液。将单细胞悬液加入未包被的培养瓶中培养,然后再次将细胞悬液加入未包被的培养瓶中,具体差速时间根据观察决定。最后将差速贴壁后含未贴壁细胞的细胞悬液加入多聚赖氨酸包被的培养瓶或培养板中,用3种方法纯化培养：阿糖胞苷法、无血清饥饿法和间断神经营养因子3法纯化培养人胚嗅球嗅鞘细胞。比较3种纯化方法下嗅鞘细胞生长变化及纯度。结果：①培养早期嗅鞘细胞呈圆形,随着培养过程进行细胞逐渐伸出细长突起呈双极、三极和多极细胞,胞核位于细胞中央。成熟的嗅鞘细胞大多呈双极、三极细胞与许旺细胞相似,细胞折光性好,胞核呈圆形位于细胞中央,＂煎蛋样＂细胞少见。②差速贴壁法培养3-6d时纯度为88%,以后成纤维细胞增殖嗅鞘细胞纯度迅速下降。阿糖胞苷法阿糖胞苷作用后细胞大量死亡,免疫染色几乎未见阳性反应细胞存在。无血清饥饿法培养3-6d时嗅鞘细胞纯度为90%,但细胞状态差。间断神经营养因子3法培养3-9d时嗅鞘细胞纯度为95%,且细胞状态良好。结论：差速贴壁结合间断间断神经营养因子3法比结合阿糖胞苷法、无血清饥饿法获得的嗅鞘细胞纯度高,且细胞状态良好。
- 王斌贺西京历强李浩鹏王栋
- 关键词：嗅鞘细胞细胞培养纯化
- 差速贴壁结合神经营养因子3体外纯化培养人胚嗅鞘细胞被引量：12
- 2007年
- 目的:采用差速贴壁结合神经营养因子3的方法对人胚嗅球嗅鞘细胞进行原代纯化培养,探讨简单实用的嗅鞘细胞体外培养方法。方法:将差速贴壁后人胚嗅鞘细胞间隔48h用含100mL/L胎牛血清和含NT3的DF12培养液交替进行体外培养。观察嗅鞘细胞的生长变化,采用形态学和P75免疫细胞化学染色进行细胞及纯度鉴定。结果:体外培养的人胚嗅鞘细胞P75染色呈阳性反应,呈双极、三极细胞,细胞突起细长,并可形成细胞突起网络。在体外培养9d时可以获得95%的嗅鞘细胞,12d时为83%,且细胞状态良好。结论:差速贴壁法结合间断NT3应用是一种简单实用的嗅鞘细胞纯化培养方法。
- 历强贺西京饶国洲董恩霞樊沛王斌朱振中臧全金
- 关键词：嗅鞘细胞细胞培养纯化
- 嗅鞘细胞移植后脊髓损伤区髓磷脂相关糖蛋白表达的动态变化被引量：7
- 2006年
- 目的:观察嗅鞘细胞移植对脊髓损伤区轴突生长抑制因子髓磷脂相关糖蛋白的影响。方法:实验于2005-08/2006-02在西安交通大学教育部环境与疾病相关基因研究重点实验室完成。①选取成年SD大鼠40只,随机数字表法分为正常组、模型组、DF12对照组、嗅鞘细胞组,10只/组。②除正常组外,其余各组均建立脊髓全横断损伤模型。术后嗅鞘细胞组在距损伤缘上下各1mm处注射原代培养12d的成年大鼠嗅鞘细胞悬液,浓度调整为1×1011L-1,深度均为1.0mm,每处各注射细胞悬液1μL。DF12对照组注射DF12培养液,方法与剂量同上。模型组、正常组均不进行任何移植处理。③分别于移植后1,4,8周采用组织学、行为学方法和免疫印迹技术检测各组动物脊髓损伤区髓磷脂相关糖蛋白表达的变化。结果:实验选取40只SD大鼠均进入结果分析。①组织学检查嗜银染色结果:移植8周后除正常组外,其余各组均可见明显的神经纤维再生,但模型组、DF12对照组大部分纤维排列紊乱如乱发状,明显迂曲;而嗅鞘细胞组新生轴突明显,无论数量还是质量都优于模型组及DF12对照组。②移植后不同时间点各组下肢运动功能检测BBB评分结果的比较:移植1,4,8周,嗅鞘细胞组BBB评分均明显高于模型组、DF12对照组,且移植4,8周时差异有显著性意义[(5.25±1.28),(1.62±1.50),(2.25±1.03)分;(11.5±2.20),(4.37±1.84),(3.75±1.03)分;F=18.090～47.635,P均<0.01]。③髓磷脂相关糖蛋白westernblot检测结果:模型组、DF12对照组、嗅鞘细胞组脊髓损伤后髓磷脂相关糖蛋白的表达明显增强,均明显高于正常组(P<0.05);但嗅鞘细胞组明显低于模型组、DF12对照组(P<0.05)。结论:嗅鞘细胞移植可能通过降低脊髓损伤后损伤区髓磷脂相关糖蛋白的表达,从而促进损伤脊髓的修复。
- 袁普卫贺西京李浩鹏王国毓王栋常瑞石剑锋
- 关键词：髓磷脂相关糖蛋白脊髓损伤
- 硫酸软骨素酶ABC联合嗅鞘细胞移植修复大鼠亚急性脊髓损伤的实验研究被引量：8
- 2009年
- 目的分析大鼠亚急性脊髓损伤(spinal cord injury,SCI)后联合应用嗅鞘细胞(olfactory ensheathing cells,OECs)和硫酸软骨素酶ABC(chondroitinase ABC,ChABC)移植的可行性,并探讨其相互作用。方法取健康成年SD大鼠3只,分离嗅球培养OECs,原代培养8～9d后调整细胞浓度为1×105个/μL备用。另取健康成年SD大鼠54只制备SCI动物模型,并随机分为4组;A组(n=36)为对照组,不作处理,B、C、D组(n=6)分别于损伤区注射OECs、ChABC和ChABC/OECs。采用BBB评分法评价伤后1、2、3、7、14d各组大鼠双后肢运动功能。A组分别于伤后即刻,1、2、3、7、14d取材(n=6),B、C、D组于伤后14d取材行HE染色并计算损伤区最大横径和坏死总面积;行胶质细胞酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)/CS56、GFAP/生长相关蛋白43(growth associated protein43,GAP-43)和GFAP/神经丝蛋白160(neurofilament 160,NF160)免疫荧光染色,评价神经纤维束再生情况。结果各组各时间点BBB评分结果示,A组与B、C、D组比较差异均有统计学意义(P<0.05),B、C组与D组比较差异有统计学意义(P<0.05)。HE染色示,伤后14d时各组均有空洞形成,伤后B、C、D组损伤区最大横径和坏死总面积与A组比较差异均有统计学意义(P<0.01),B、C组与D组比较差异有统计学意义(P<0.01)。免疫组织化学染色示,A组GFAP反应最强,损伤区空洞明显可见,范围大于其他3组;D组介于B、C组之间;B、C、D组的GAP-43表达增多,且以D组为著;D组损伤区内的NF通过明显多于其他3组。结论ChABC联合OECs移植对亚急性SCI有较好的疗效。
- 张纯贺西京兰宾尚李浩鹏
- 关键词：嗅鞘细胞细胞移植脊髓损伤
- 不同纯化方法体外培养人胚嗅球嗅鞘细胞被引量：7
- 2008年
- 目的采用不同纯化方法原代培养人胚嗅球嗅鞘细胞(OECs),探讨简单实用可获得高纯度人胚嗅球OECs的体外培养方法。方法以差速贴壁法为基础结合阿糖胞苷法、无血清饥饿法和间断神经营养因子3(NT3)法纯化培养人胚嗅球OECs。观察不同纯化方法下OECs生长变化,采用免疫细胞化学染色进行纯度鉴定。结果体外培养的人胚嗅球OECs为双极、三极细胞,细胞突起细长,并可形成细胞突起网络。差速贴壁法培养3～6 d时纯度约为88%,以后成纤维细胞增殖,OECs纯度迅速下降。无血清饥饿法培养3～6 d时OECs纯度约为90%,但细胞状态差。间断NT3法培养3～9 d时OECs纯度约为95%,且细胞状态良好。经统计学处理,第6 d后差速贴壁+间断应用NT3法优于其他方法,细胞纯度的差异有统计学意义(P<0.05)。结论差速贴壁结合间断NT3法可获得高纯度状态良好的OECs,是一种简单实用的OECs纯化培养方法。
- 王斌贺西京历强李浩鹏王栋
- 关键词：嗅鞘细胞细胞培养纯化神经营养因子3
- 嗅鞘细胞移植对脊髓损伤区勿动蛋白表达的影响被引量：8
- 2008年
- 背景：近年来人们认为只要能抑制脊髓损伤后神经再生的不利因素就能促进损伤脊髓的再生，抑制因子包括髓鞘相关抑制分子和胶质瘢痕。其中髓鞘相关抑制分子主要有勿动蛋白、髓磷脂相关糖蛋白及少突起胶质细胞髓鞘相关糖蛋白。目的：观察嗅鞘细胞移植前后脊髓损伤区勿动蛋白的动态变化。设计、时间及地点：开放性实验，于2006—09／2007—05在西安交大医学院教育部环境与基因重点实验室完成。材料：8周龄成年SD大鼠40只，体质量（2．50±0．25）kg，雌雄不拘，随机数字表法分为正常组、模型组、嗅鞘细胞组、DF12对照组，10只／组。另取30只健康成年雄性SD大鼠用于嗅鞘细胞的取材，体质量200～250g。方法：除正常组外，其余各组均建立全横切脊髓损伤模型。嗅鞘细胞组将原代培养12d的嗅鞘细胞悬液调整为1×10^11L^-1，在距损伤缘上下各1mm处分4点应用微量注射器注射，深度1．0mm，每处各注射1μL。DF12对照组同法每点注射等量DF12培养液，模型组、正常组不进行任何处理。主要观察指标：各组分别于移植后1，4，8周采用免疫组织化学技术动态检测脊髓损伤区勿动蛋白的变化。同时在移植后8周行嗜银染色检测组织形态学变化。结果：①勿动蛋白的变化：正常组勿动蛋白吸光度值明显低于其余3组（P〈0．05）。移植后1，4，8周，嗅鞘细胞组脊髓损伤区勿动蛋白均明显低于模型组和DF12对照组（P〈0．01），而模型组和DF12对照组差异无显著性意义（P〉0．01）。②组织形态学变化：嗅鞘细胞移植8周后，除正常组外，其余各组均可见明显的神经纤维再生，但模型组与DF12对照组大部分纤维排列紊乱，再生纤维方向性较差；嗅鞘细胞组可见明显的新生轴突，且神经纤维跨越损伤部位修复脊髓损伤，无论在数量还是质量上均优于模型组及DF12对照
- 袁普卫贺西京王国毓郝阳泉
- 关键词：脊髓损伤勿动蛋白免疫组织化学嗅鞘细胞
- 嗅鞘细胞移植对脊髓损伤区RhoA表达的影响被引量：8
- 2007年
- 目的:轴突生长抑制分子须与其共同复合受体结合后才能激活下游抑制信号RhoA,从而导致细胞骨架塌陷,抑制神经再生。基础及临床研究均证实嗅鞘细胞能够促进脊髓功能的恢复,观察嗅鞘细胞移植前后脊髓损伤区RhoA的动态变化,探讨嗅鞘细胞移植治疗脊髓损伤的可能机制。方法:实验于2005-09/2006-05在西安交大医学院环境与基因重点实验室完成。①实验动物:成年SD大鼠40只,随机数字表法分为正常组、模型组、嗅鞘细胞组、DF12对照组,10只/组。另取30只健康成年雄性SD大鼠作为嗅鞘细胞的来源。实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准。②实验方法:大鼠麻醉后处死,迅速取出头部两侧嗅球,除去软膜,剪取嗅球外面的嗅神经层和小球层,剪碎后离心,胰蛋白酶消化获取嗅鞘细胞悬液。除正常组外,其余各组均建立全横切脊髓损伤模型。嗅鞘细胞组将原代培养12 d的嗅鞘细胞悬液调整为1×10^(11)L^(-1),在距损伤缘上下各1 mm处分4点应用微量注射器注射,深度1.0 mm,每处各注射1μL。DF12对照组同法每点注射等量DF12培养液,模型组、正常组不进行任何处理。③实验评估:各组分别于移植后1,2,4,6,8周采用免疫组化和Western blot免疫印迹技术动态检测脊髓损伤区RhoA表达的变化。同时在移植后8周行嗜银染色检测组织形态学变化。结果:①RhoA表达的变化:正常组RhoA表达的吸光度值明显低于其余3组(P<0.05)。嗅鞘细胞组于移植后1,2,4,6,8周脊髓损伤区RhoA的表达均明显低于模型组和DF12对照组(P<0.01),而模型组和DF12对照组差异无显著性意义(P> 0.01)。②组织形态学变化:嗅鞘细胞移植8周后除正常组外,其余各组均可见明显的神经纤维再生,但模型组与DF12对照组大部分纤维排列紊乱,再生纤维方向性较差;嗅鞘细胞组可见明显的新生轴突,且神经纤维跨越损伤部位修复脊髓损伤,无论在数量�
- 袁普卫贺西京楚向东李智斌昝强刘德玉
- 关键词：嗅鞘细胞移植脊髓损伤RHOA免疫印迹
- 硫酸软骨素蛋白多糖酶结合骨髓基质干细胞修复亚急性大鼠脊髓挤压伤的实验研究被引量：4
- 2010年
- 目的分析大鼠亚急性脊髓损伤(SCI)后联合应用骨髓基质干细胞移植和硫酸软骨素酶ABC的可行性,并探讨其相互作用。方法取新生SD大鼠的股骨和胫骨分离培养MSCs,调整细胞浓度为2.0×105/cm2备用。取体质量220～240g健康成年雄性SD大鼠24只制备SCI动物模型,并随机分为4组,A组对照组,B、C、D组每组6只,分别于SCI损伤区注射5μLMSCs;5μL硫酸软骨素酶(ChABC)和ChABC+MSCs。采用BBB评分法评价伤后1、2、3、7、14d大鼠双后肢的运动功能。伤后14d取材行HE染色并计算损伤区最大横径和坏死总面积;行GFAP-CS56、GFAP-GAP-43和GFAP-NF160免疫荧光染色评价神经纤维束的再生情况。结果损伤后算14天BBB评分结果示,A组与B、C、D组比较差异均有统计学意义(P<0.05),B、D组及C、D组间比较差异均有统计学意义(P<0.05),B、C组间无显著性差异。HE染色显示14天时各组均有空洞形成,伤后坏死总面积比较,B、C、D组与A组比较均有显著性差异(P<0.05),B、C、D三组之间D组与前两组比较存在显著性差异(P<0.05)。免疫组织化学染色示,A组GFAP反应最强,损伤区空洞明显可见且范围大于其他三组,D组介于B、C组之间;B、C和D组的GAP-43表达增多,且以D组为最;D组损伤区内的神经纤维通过明显多于其他三组。结论硫酸软骨素酶ABC联合骨髓基质干细胞移植对脊髓损伤有一定修复作用。
- 张纯姚聪贺西京李浩鹏
- 关键词：骨髓基质干细胞
- 经改良的取材和差速贴壁法培养纯化嗅黏膜嗅鞘细胞被引量：4
- 2009年
- 目的:采用经改良的取材和差速贴壁法培养纯化嗅黏膜嗅鞘细胞(OECs),以探求更加简单、高效的嗅黏膜OECs取材和培养纯化方法。方法:成年雄性SD大鼠6只,采用经改良的方法剥取嗅黏膜,然后用改良差速贴壁法培养纯化嗅黏膜OECs。倒置相差显微镜下观察细胞生长情况以及形态并照相,培养7d、14d细胞行NGFRp75免疫细胞化学染色鉴定,并根据免疫细胞化学染色结果计算细胞纯度。结果:体外培养的嗅黏膜OECs形态主要有扁圆形或油煎蛋形、梭形或双极、多突起形。嗅黏膜OECsNGFRp75免疫细胞化学染色阳性。培养7d嗅黏膜OECs纯度为90%,培养14d嗅黏膜OECs纯度为85%。嗅黏膜OECs最长可以存活35d。结论:经改良的取材和差速贴壁法培养纯化嗅黏膜OECs具有简单、高效的优点,培养的嗅黏膜OECs的纯度完全可以达到细胞移植的要求。
- 田锋姜曙祥贺西京黄涛臧全金
- 关键词：嗅黏膜嗅鞘细胞免疫细胞化学
- 嗅鞘细胞联合甲基强的松龙对大鼠脊髓损伤区神经中丝表达的影响被引量：2
- 2011年
- 目的 观察嗅鞘细胞（olfactory ensheating cells,OECs）移植联合甲基强的松龙（methyprednisolone,MP）对大鼠脊髓损伤区神经中丝（neurofilament,NF）mRNA及蛋白表达的影响,探讨OECs移植联合应用MP促进损伤脊髓修复的机制.方法 以NYU脊髓打击法建立大鼠急性T10脊髓损伤模型.按随机数字表法分为A组空白组10只;B组损伤组、C组DF12组、D组OECs组、E组MP组、F组OECs＋MP组,各30只.于治疗后不同时相点,取各组大鼠损伤区脊髓应用免疫组织化学染色、反转录PCR和Western blot的方法检测NF mRNA及蛋白表达变化.结果 OECs组、MP组、OECs＋MP组与损伤组、DF12组比较,术后7,14,28 d损伤区脊髓组织NFmRNA及蛋白表达显著升高（P＜0.05）.OECs＋MP组与OECs组、MP组比较,术后7,14,28d损伤区脊髓组织NF mRNA及蛋白表达显著升高（P＜0.05）.结论 OECs移植或单纯应用MP可促进大鼠脊髓损伤区促轴突再生因子NFmRNA及蛋白表达,二者联合应用,可显著促进脊髓损伤区NF mRNA及蛋白表达,具有协同作用效果.此结果提示OECs＋MP可调控NFmRNA及蛋白表达,且此调控作用可能是OECs＋MP促进脊髓损伤修复的可能机制之一.
- 王斌贺西京历强
- 关键词：脊髓损伤嗅鞘细胞
