国家自然科学基金(30472008)
- 作品数：5 被引量：4H指数：1
- 相关作者：张正丰周跃陈超张伟王建更多>>
- 相关机构：第三军医大学新桥医院第三军医大学川北医学院附属医院更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金重庆市自然科学基金更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学化学工程更多>>
- 腺病毒介导心肌营养素-1基因转移对大鼠脊髓损伤后红核脊髓束的再生作用
- 2010年
- 目的 观察腺病毒介导心肌营养素-1基因（Adv-CT1）转移对大鼠脊髓损伤（SCI）后红核脊髓束（RST）轴突再生和前肢功能恢复的影响.方法 成年Wistar雄性大鼠24只,制备C3脊髓外侧索横切（C3Hx）模型,根据损伤区植入的不同成分分为3组（n=8）：损伤对照组（明胶海绵＋病毒缓冲液）、Adv-eGFP组（明胶海绵＋Adv-eGFP）、Adv-CT1组（明胶海绵＋Adv-CT1）.荧光金（FG）于C5注射,4周后脑切片荧光显微镜下红核神经元计数观察RST再生;生物素化葡聚糖（BDA）于红核注射,脊髓切片观察RST再生;前肢不对称实验观察行为学的改变.结果 大鼠C3Hx损伤下区注射FG逆行示踪,损伤对照组、Adv-eGFP组和Adv-CT1组标记的红核神经元分别为（12.1±4.3）、（15.2±2.6）和（33.0±5.2）个,Adv-CT1组分别与损伤对照组和Adv-eGFP组比较,差异均有统计学意义（P＜0.05）.RST的BDA顺行示踪,损伤对照组、Adv-eGFP组和Adv-CT1组损伤下区BDA标记的神经元分别为（6.0±1.3）、（6.0±1.0）和（17.1±2.0）个,Adv-CT1组分别与损伤对照组和Adv-eGFP组比较,差异均有统计学意义（P＜0.05）.大鼠C3Hx4周后AdV-CT1组使用伤肢时间（9.3%±3.3%）明显比损伤对照组（3.6%±1.4%）和Adv-eGFP组（4.1%±2.6%）时间长,差异均有统计学意义（P＜0.05）.结论 Adv-CT1转移促进RST再生和SCI后前肢功能部分恢复.
- 张正丰陈超王建周跃廖维宏
- 关键词：脊髓损伤基因腺病毒科
- 心肌营养素1／破伤风毒素重链C端片段融合蛋白的构建及其靶向大鼠嗜铬细胞瘤细胞的研究被引量：1
- 2008年
- 目的:探讨心肌营养素1(cardiotrophin 1,CT1)/破伤风毒素重链C端片段(tentanus toxin Cfragment,TTC)(CT1/TTC)融合蛋白的构建及其对大鼠嗜铬细胞瘤(pheochromocytoma,PC12)细胞的靶向性。方法:采用聚合酶链式反应(PCR)、T-A克隆等分子生物学方法构建CT1/TTC融合蛋白。体外培养PC12细胞,并将CT1/TTC融合蛋白与PC12细胞共培养,红色荧光免疫组化染色后在激光共聚焦显微镜下观察融合蛋白能否在TTC的靶向作用下进入PC12细胞。结果:成功构建了CT1/TTC融合蛋白,测序显示融合基因序列正确,免疫组化染色结果显示融合蛋白能够进入PC12细胞,并发出红色荧光。结论:采用PCR和T-A克隆等分子生物学方法能成功构建CT1/TTC融合蛋白,并且TTC能够将CT1靶向进入PC12细胞。
- 张伟张正丰周跃蔚芃蒋成陈超
- 关键词：心肌营养素融合蛋白
- CT-1及TTC的GST融合蛋白表达质粒的构建及表达被引量：1
- 2006年
- 目的构建心肌营养素-1(CT-1)和破伤风外毒素C片段(TTC)重组融合蛋白表达质粒。方法利用PCR、TA克隆等技术将CT-1及TTC基因克隆并连接到pGEX-4T-3,再做酶切鉴定、序列测定。在不同温度不同时间,通过IPTG诱导pGEX-CT-1/TTC在DH5α大肠杆菌中表达,SDS-PAGE分析表达量和可溶性蛋白GST-CT-1/TTC比例。结果构建的pGEX-CT-1/TTC酶切结果可见606 bp1、356 bp大小的片段,与预期结果一致,测序结果表明序列正确。通过IPTG诱导,发现35℃诱导4 h,目的蛋白GST-CT-1/TTC表达量占全菌的1/5,可溶性蛋白与包涵体比为2/5。结论本实验成功构建了pGEX-CT-1/TTC重组融合质粒,为下一步将其用于脊髓损伤的治疗研究打下了基础。
- 张伟周跃张正丰李鑫兴
- 关键词：心肌营养素-1质粒
- TAT/CT-1及TAT/EGFP融合蛋白的表达与纯化及其在小鼠体内分布的观察
- 2006年
- 目的分别构建含蛋白转导域(protein transduction domain,PTD)TAT与小鼠心肌营养素-1(CT-1)及TAT与增强绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)融合基因片断的原核表达质粒TAT/CT-1及TAT/EGFP,利用大肠杆菌进行表达并纯化;观察融合蛋白在小鼠体内的分布。方法采用PCR及克隆技术将CT-1编码区基因以及EGFP基因分别与TAT连接到原核表达载体pGEX-4T3上。用IPTG诱导表达融合蛋白,谷胱甘肽琼脂糖4B纯化融合蛋白。小鼠尾静脉注射融合蛋白,脑、脊髓、肝、心肌等器官冰冻切片,免疫荧光观察融合蛋白的存在。结果目的片断CT-1及EGFP被有效的扩增,构建后质粒测序表明无PCR引起的突变,TAT/CT-1及TAT/EGFP在转化的大肠杆菌中获得高效表达,并成功纯化。脑、脊髓、肝、心肌等组织切片免疫荧光检测呈阳性。结论成功获得了有活性的TAT/CT-1及TAT/EGFP的基因表达产物;TAT可介导CT-1及EGFP由细胞外跨膜转导进入细胞内;为CT-1功能的进一步研究打下了基础。
- 李兴鑫周跃张正丰
- 关键词：心肌营养素-1蛋白转导域小鼠
- 破伤风毒素C端片段与心肌营养素-1融合蛋白表达、纯化与靶向神经元逆向运输及神经营养活性鉴定被引量：2
- 2009年
- 目的在BL21（DE3）大肠杆菌中表达破伤风毒素C端片段（TFC）与心肌营养素（CT）-1融合蛋白并纯化。探讨TTC转导结构域对CT-1的靶向神经元逆向运输活性与CT．1的神经营养活性。方法异丙基-B—D硫代半乳糖苷（IPTG）诱导BL2（DE3）大肠杆菌表达CT-1／TYC融合蛋白，SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS—PAGE）与WB法鉴定融合蛋白表达。制备SD大鼠坐骨神经损伤模型，分别经神经再生室、肌肉注射给药，自由放养1周后处死，4％多聚甲醛灌注固定，取脊髓L4～L6腰膨大标本，冰冻切片，免疫组织化学检测。制备新生6～7d龄sD大鼠坐骨神经损伤模型，肌肉注射CT-1／TTC融合蛋白，自由放养1周后处死，4％多聚甲醛灌注固定，取L4～L6腰膨大标本，冰冻切片，尼氏染色计数脊髓前角运动神经元。结果原核表达目的蛋白CT-1／TTC表达量占全菌蛋白总量的15％，以可溶性蛋白为主。通过谷胱甘肽S-转移酶（GST）标签亲和纯化获得2.7g／L的CT-1／TTC重组融合蛋白。免疫组织化学于脊髓腰膨大检测到CT-1／TTC融合蛋白。坐骨神经损伤后，脊髓L4-L6腰膨大前角运动神经元计数较CT-1／TTC融合蛋白处理组减少，存活率下降。结论基因重组CT-1／TTC蛋白在大肠杆菌中获得了表达和纯化，所获得的融合蛋白有靶向性脊髓神经元细胞的活性和对损伤后运动神经元的神经营养活性。
- 陈超王建杨萍周跃张正丰
- 关键词：重组融合蛋白质类破伤风毒素心肌营养素-1
