公共文化服务平台

山西省自然科学基金(20051114): 作品数：14 被引量：34H指数：4; 相关作者：刘明社赵中夫张国英张芸杨慧更多>>; 相关机构：长治医学院山西医科大学第一医院山西医科大学更多>>; 发文基金：山西省自然科学基金更多>>; 相关领域：医药卫生更多>>

鼠HMGB1蛋白的原核表达及分离纯化被引量：1: 2007年; 目的:克隆小鼠HMGB1基因,构建原核表达载体,在大肠杆菌中诱导表达并分离纯化获得His-HMGB1的融合蛋白。方法:脂多糖刺激后的RAW264.7细胞,提取总RNA,经RT-PCR扩增出含HMGB1的目的片段,克隆于pMD-19T载体,再亚克隆至含有pelB引导肽及His-标签肽的高效表达载体pET-26b(+),转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导后行SDS-PAGE鉴定目标蛋白表达,用镍鳌合琼脂糖凝胶亲和层析法分离纯化含His-标签肽的目的蛋白。结果:经PCR扩增出大小为648bp的HMGB1基因片段,成功构建目标蛋白的融合表达载体,经诱导表达及分离纯化,获得了约30kD的融合蛋白。结论:构建HMGB1的融合表达载体,获得分离纯化融合蛋白His-HMGB1,为进一步研究其生物学功能奠定了基础。; 赵中夫杨慧刘明社张芸杨柳絮封江南; 关键词：高迁移率族蛋白1 原核表达载体纯化

以HepG2.2.15细胞为对象的RNAi实验研究被引量：1: 2006年; 目的观察针对乙型肝炎病毒(HBV)X区设计的siRNA表达载体pGenesil-HBVX对HepG2.2.15细胞相应蛋白表达的影响。方法筛选出最佳转染效率的剂量配比,将阳离子脂质体METAFECTENE与pGen-esil-HBVX的复合物转染HepG2.2.15细胞,于转染后24、48、72h采用时间分辨荧光免疫测定技术(TRFIA)检测上清液中乙型肝炎表面抗原(HBsAg)和乙型肝炎e抗原(HBeAg)。结果具有最佳转染效率而且不显著影响细胞活性的剂量配比为8μl∶2.5μg。pGenesil-HBVX转染HepG2.2.15细胞后24h,细胞上清液中HBsAg、HBeAg含量尚无显著变化(P>0.05);48h后HBsAg、HBeAg表达均有明显下降(P<0.01),并且持续至72h。结论pGenesil-HBVX可以在获得一定转染效率的基础上有效抑制HepG2.2.15细胞中HBV的表达。; 刘明社杨慧赵中夫赵龙凤张国英张芸韩德五; 关键词：HEPG2.2.15细胞乙型肝炎病毒 RNA干扰质粒载体

RNA干扰抑制HepG2细胞AFP基因表达实验方法建立被引量：3: 2006年; 目的:筛选较理想的阳离子脂质体META/pGenesil-AFP质粒转染HepG2的方法。方法:将针对两条靶序列AFP1和AFP2的shRNA的DNA模板双链,连接于质粒表达载体,构建质粒载体pGenesil-1-AFP1(含绿色荧光蛋白GEP编码序列)及pGenesil-2-AFP2,用阳离子脂质体META/质粒载体pGenesil-1-AFP1转染HepG2细胞。荧光显微镜观察并计算不同剂量配比的脂质体/质粒载体混合液转染效果及微粒子化学发光免疫分析法检测不同剂量配比转染后对AFP基因表达的影响。结果:剂量比为8μL∶2.5μg条件,能有效地转染HepG2细胞,并有效抑制AFP表达且无细胞毒性作用。结论:本研究成功建立了阳离子脂质体META/质粒载体pGenesil-1-AFP1转染HepG2细胞实验方法。; 张国英杨慧刘明社张芸赵中夫; 关键词：HEPG2细胞 RNA干扰 AFP

pGenesil-siHBV X对HepG2.2.15细胞HBV表达和复制的抑制效果研究: 2007年; 目的研究针对HBVX基因区设计的小干扰RNA(siRNA)表达载体质粒pGenesil-siHBVX对HepG2.2.15细胞HBV表达和复制的抑制效果及特异性。方法针对HBVX区设计siRNA表达载体质粒pGenesil-siHBVX。分别用培养液(空白对照)、脂质体Metafectene、pGenesil空载体、pGenesil-siHK(阴性对照)、pGenesil-siAFP(特异性对照)、pGenesil-siHBVX处理或转染HepG2.2.15细胞各3次。于每次转染后24h,取各组细胞培养上清液,用时间分辨荧光免疫测定技术检测上清液中HBsAg和HBeAg含量,用化学发光法检测AFP含量,用PCR荧光定量技术检测HBV-DNA复制水平。结果pGenesil-siHBVX转染能抑制HepG2.2.15细胞对HBV标志物的表达,且抑制作用随转染次数增加而增强。第3次转染后,pGenesil-siHBVX组细胞上清液中HBsAg、HBeAg和HBV-DNA检测结果分别为(6.26±1.07)ng/ml、(0.13±0.05)Ncu/ml和(3.01±0.40)×107拷贝/ml,与空白对照组的(22.50±1.39)ng/ml、(1.12±0.11)Ncu/ml和(12.33±1.28)×107拷贝/ml比较,差异有统计学意义(t值分别为12.80、12.21、9.71,P<0.05);pGenesil-siHBVX转染不影响细胞对AFP的表达(t=0.18,P=0.86)。结论pGenesil-siHBVX可以有效和特异地抑制HepG2.2.15细胞HBV-DNA的复制及HBsAg和HBeAg表达。; 杨慧赵中夫张国英张芸刘明社杨柳絮; 关键词：RNA干扰质粒

串联表达Fas shRNA腺病毒载体的构建被引量：3: 2006年; 目的利用串联表达质粒pEGFP6-1-siFas1+siFas2和BDAdeno-X系统构建腺病毒表达Fas-shRNA载体。方法双酶切pEGFP6-1-siFas1+siFas2串联表达质粒和pShuttle2质粒,T4DNA连接酶连接胶回收片段,转化感受态Escherichiacoli(E.coli)DH5α菌株,挑取单克隆菌落LB(Luria-Bertani)培养基中扩增培养;小量质粒试剂盒提取pShuttle2-siFas1+siFas2质粒,酶切鉴定;双酶切pShuttle2-siFas1+siFas2质粒,T4DNA连接酶连接酶切产物和腺病毒BDAdeno-XViralDNA。回收连接产物,SwaI酶切去除未重组的腺病毒质粒,再回收酶切产物,转化感受态E.coliDH5α;聚合酶链反应(PCR)筛选鉴定阳性克隆;提取pAdeno-siFas1+siFas2质粒,进一步酶切鉴定;重组腺病毒pAdeno-siFas1+siFas2质粒线性化,经脂质体转染HEK293A细胞;收细胞进行裂解收病毒。结果构建表达2个Fas-shRNA的串联重组腺病毒载体pAdeno-siFas1+siFas2,经酶切鉴定和PCR分析,重组腺病毒质粒构建正确;经HEK293A细胞包装成功。结论成功构建表达2个Fas-shRNA的串联重组腺病毒载体pAdeno-siFas1+siFas2,为进一步转染细胞和感染小鼠抑制Fas基因表达奠定了基础。; 刘明社赵中夫王兰张国英张芸杨慧封江南; 关键词：CD95 HAIRPIN 腺病毒科

RNAi沉默Fas受体表达的腺病毒载体构建: 2006年; 目的:利用pEGFP6-1和pGenesil-1质粒构建针对小鼠Fas的2个短发卡状RNA(short hairpinRNA,shRNA)串联表达的载体pEGFP6-1-siFas1+siFas2,进一步通过BDAdeno-X系统构建腺病毒表达Fas-shRNA载体。方法:设计表达2个短发卡状RNA结构的互补DNA序列分别克隆至质粒载体pEGFP6-1和pGenesil-1中,酶切pEGFP6-1-siFas1大片段和酶切pGenesil-1-siFas2小片段,经T4DNALigase连接得到pEGFP6-1-siFas1+siFas2重组质粒。双酶切重组质粒和pShuttle2穿梭质粒,经T4DNA连接酶连接得到pShuttle2-siFas1+siFas2质粒。双酶切重组穿梭质粒,连接酶切产物和腺病毒转化感受态E.coilDH5а,PCR筛选鉴定阳性克隆,进一步线性化重组腺病毒pAdeno-siFas1+siFas2质粒,经脂质体转染HEK293A细胞;收细胞进行裂解收病毒。结果:构建的重组质粒载体经酶切鉴定和测序分析,shRNA编码序列与设计的片段完全一致;重组腺病毒载体经酶切鉴定和PCR分析正确;经HEK293A细胞包装成功,能够表达绿色荧光蛋白。结论:成功构建Fas-shRNA腺病毒串联表达载体。; 刘明社赵中夫王兰张国英张芸封江南; 关键词：RNAI SHRNA

RNA干扰Fas基因表达的免疫组化半定量分析被引量：10: 2007年; 目的:探索图像分析技术在Fas蛋白表达检测中的作用。方法:用Image Pro Plus(IPP)软件图像半定量分析技术,判定RNA干扰抑制Fas基因后小鼠肝组织免疫组织化学染色切片和Western Blot检测的Fas蛋白表达情况。结果:RNA干扰有效抑制了Fas基因的表达,IPP图像分析方法显示,Fas蛋白表达在免疫组织化学染色切片的差异与Western Blot检测结果一致。结论:Image Pro Plus图像分析手段有利于通过半定量的方式判定Fas蛋白表达的变化。; 刘明社赵中夫张国英张芸武延隽; 关键词：RNA干扰 FAS蛋白免疫组织化学

腺病毒载体RNAi技术抑制血吸虫病小鼠肝细胞Fas表达被引量：7: 2007年; 目的探讨RNAi技术对血吸虫病肝组织中Fas表达的作用。方法采用尾静脉注射腺病毒载体,在小鼠体内表达Fas-shRNA抑制血吸虫病小鼠肝细胞Fas的表达。冰冻切片荧光显微镜检查腺病毒载体对肝细胞的转染率,免疫组化和Western Blot方法检测肝组织Fas表达情况,RT-PCR方法检测肝组织Fas mRNA表达情况。结果免疫组化和Western Blot方法检测均表明RNAi组Fas表达受到抑制(t=29.799,P<0.01),模型组和HK对照组Fas表达增强。对Fas mRNA表达的RT-PCR方法检测也与上述结果一致。腺病毒载体对肝细胞的转染率达78.5%。结论腺病毒载体Fas-shRNA能够有效抑制血吸虫病小鼠肝细胞Fas的表达,尾静脉注射腺病毒载体能高效率感染肝细胞。; 刘明社汪世平赵中夫王兰杨慧张国英张芸; 关键词：RNAI 腺病毒载体血吸虫病 BALB/C小鼠

乙型肝炎病毒X基因区短发夹RNA表达载体的构建与活性鉴定被引量：1: 2012年; 慢性乙型肝炎是严重危害人类健康的疾病和公共卫生问题。HBV的持续复制是肝炎活动的始动因素，是促使肝纤维化、肝硬化乃至进一步发展为肝癌的主要原因。尽管干扰素及各种核苷（酸）类似物等抗病毒药物的出现为乙型肝炎患者带来了希望，但疗效仍不满意。RNA干扰（RNA interference，RNAi）技术以其高效、特异、彻底的基因沉默作用，; 杨慧赵龙凤赵中夫刘明社王艳刘超张国英; 关键词：乙型肝炎病毒X 短发夹RNA 活性鉴定核苷(酸)类似物公共卫生问题慢性乙型肝炎

干扰AFP蛋白表达的shRNA表达载体的构建及活性鉴定: 2007年; 目的:利用含报告基因EGFP的pGenesil-1质粒构建干扰AFP蛋白表达的短发夹RNA (short hairpin RNA,shRNA)表达的载体,并进行活性鉴定。方法:设计表达短发夹RNA的互补DNA序列,经退火成双链,克隆至带有U6启动子的质粒载体pGenesil-1中,构建重组质粒,转化大肠杆菌DH5α菌株,扩增,提取质粒,酶切鉴定后测序分析。构建正确的重组质粒经脂质体转染HepG2细胞,检测转染率和培养细胞上清的AFP含量变化,确定重组质粒的活性。结果:构建了靶向AFP蛋白的2个shRNA重组质粒载体pGenesil-1-siAFP1和pGenesil-1-siAFP2。酶切鉴定和测序分析,shRNA编码序列与设计的片段完全一致,经酶切凝胶电泳证实载体构建成功。重组质粒有效转染HepG2细胞并显著抑制AFP表达。结论:成功构建具有活性的、能够表达shRNA靶向干扰AFP蛋白的2个重组质粒载体。; 张国英刘明社赵中夫张芸杨慧武延隽; 关键词：RNAI SHRNA

山西省自然科学基金(20051114)

文献类型

领域

主题

机构

作者

传媒

年份

用户反馈

山西省自然科学基金(20051114)

文献类型

领域

主题

机构

作者

传媒

年份

用户登录

用户反馈