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我国鸡群禽戊型肝炎病毒RT-PCR检测及部分ORF2基因序列分析被引量：2: 2010年; 为从核酸水平证实我国鸡群中禽戊型肝炎病毒(HEV)的存在,本实验从山东省某鸡场患有肝脾肿大综合征的病鸡中采集10份粪便和8份胆汁样品,利用RT-PCR方法检测其中禽HEV ORF2基因片段,并将阳性PCR产物克隆测序。结果显示:18份粪便和胆汁样品中,13份为禽HEV RNA阳性;其序列间的同源性为97%～99%,与GenBank中登录的参考序列同源性为76.6%～98.1%;进化树显示与欧洲地区的禽HEV在同一分支,属于禽HEV基因3型。禽HEV ORF2基因的检出为进一步了解禽HEV对我国家禽养殖业的危害以及在我国的流行情况奠定了基础。; 赵钦周恩民孙培明董施伟张璐孙亚妮姜世金; 关键词：ORF2基因

山东泰安市猪戊型肝炎病毒的检测及序列分析被引量：6: 2011年; 为了解山东泰安市猪戊型肝炎病毒(Hepatitis E virus,HEV)感染情况及其对职业人群的危害,从山东省某屠宰场共收集来自泰安市的106份猪胆汁样品,利用逆转录套式聚合酶链式反应(reverse transcription nested polymerase chain reaction,RT-nPCR)检测HEV开放阅读框(open reading frame 2,ORF2)保守区基因,其中32份为阳性,阳性率为30.2%。同时随机挑选20个阳性样品克隆测序,并与GenBank上的参考序列进行同源性比较,发现所获得的序列与9株HEV基因Ⅳ型参考序列之间的核苷酸同源性最高,为83.6%～92.8%。其中3株与中国猪源HEV swGX32株(EU366959)亲缘关系近(90.8%),属于4a亚型,另外17株与新疆猪源HEVswCH25株(AY594199)和人源HEVT1株(AJ272108)亲缘关系近(87.9%～92.8%),属于4d亚型。调查结果表明该地区猪戊型肝炎病毒的阳性率很高,而且进一步证实猪源HEV和人源HEV有较高的同源性,对人类的身体健康具有潜在威胁。; 宋腾飞赵钦姚永红肖一红周恩民; 关键词：猪戊型肝炎病毒 ORF2基因

猪戊型肝炎病毒Ⅳ型衣壳蛋白单克隆抗体的制备与鉴定: 2012年; 为获得猪戊型肝炎病毒(Hepatitis E virus,HEV)Ⅳ型衣壳蛋白单克隆抗体,将猪HEV衣壳蛋白的C端267(408—675)个氨基酸基因序列克隆入原核表达载体pET-28a(+),构建重组质粒pET-28a-ORF2-C,转化E.coli Rosetta(BL21)感受态细胞进行诱导表达,SDS-PAGE和Western blot鉴定,纯化后免疫小鼠。取免疫小鼠的脾脏与鼠骨髓瘤细胞SP2/0融合制备单克隆抗体。通过间接ELISA和竞争ELISA方法筛选并鉴定单抗。结果表明蛋白得到正确、高效表达,获得3株识别不同的抗原表位区的单克隆抗体,分别命名为Mab-1E4(IgG1)、Mab-2C7(IgG1)和Mab-2G9(IgG2b),其中1E4和2G9能阻断临床阳性猪血清,提示该2株单克隆抗体识别的抗原表位是猪HEVⅣ型衣壳蛋白上重要的抗原表位区,而单抗Mab-2C7不能阻断。本研究为猪HEVⅣ型的诊断及研究提供重要工具。; 赵菲菲赵钦胡守彬陈福勇肖一红周恩民; 关键词：猪戊型肝炎病毒衣壳蛋白单克隆抗体

禽戊型肝炎病毒中国分离株ORF3蛋白的真核表达与抗原性分析: 2012年; 【目的】为获得禽戊型肝炎病毒(hepatitis E virus,HEV)中国分离株(CaHEV)ORF3基因重组蛋白,并对其抗原性进行分析【。方法】提取CaHEV总RNA,通过RT-PCR获得ORF3基因,构建重组质粒pFastBac-HTB-ORF3,转座DH10Bac感受态细胞,提取重组杆粒Bacmid-ORF3,转染sf9细胞,用SDS-PAGE、IFA和Western blot对重组蛋白表达进行鉴定。优化表达条件,将纯化的ORF3蛋白免疫小鼠制备多克隆抗体,用制备的多抗分别与截短表达的3段CaHEV ORF3蛋白进行Western blot和ELISA检测,分析ORF3蛋白的抗原表位区。【结果】SDS-PAGE、Western blot和IFA结果表明CaHEV ORF3蛋白被成功表达且存在细胞内,昆虫细胞在接毒后4天表达量最高。将ORF3重组蛋白免疫小鼠,利用间接ELISA方法,对制备的多抗倍比稀释检测,效价达到104,Western blot和ELISA分析表明ORF3蛋白C端74—88氨基酸处具有较强的抗原性。【结论】本试验用Bac-to-bac系统成功构建含有CaHEV ORF3基因的重组杆状病毒,并在昆虫细胞中得到表达,其主要抗原表位位于C端74—88氨基酸,为进一步研究禽HEV ORF3的蛋白结构和功能奠定了基础。; 胡守彬赵钦赵菲菲肖一红周恩民; 关键词：真核表达抗原性

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山东省“泰山学者”建设工程项目(040-72010)