国家自然科学基金(30772468)
- 作品数：11 被引量：37H指数：5
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- 相关领域：医药卫生理学更多>>
- 小鼠pcDNA3.1（＋）-烯酰水合酶辅酶1真核表达质粒的构建及鉴定被引量：2
- 2011年
- 淋巴道转移是影响上皮来源恶性肿瘤患者预后的重要因素[1],澄清其转移机制意义重大.烯酰水合酶辅酶1（enoyl coenzyme A hydratase 1,ECH1）是一种具有烯酰辅酶水合酶活性的酶,该基因表达于细胞的过氧化物酶体,与多种肿瘤相关.
- 王梅唐建武宋波王波张军魏元怡张宇虹刘纪文
- 关键词：真核表达质粒合酶小鼠过氧化物酶体
- 氯离子通道1过表达对小鼠肝癌细胞株Hca-P生物学行为的影响被引量：1
- 2012年
- 背景与目的:氯离子通道l(chloride intracellular channel l,CLICl)是CLIC家族中的一员,研究表明CLIC1与肿瘤转移相关。本研究旨在探讨CLICl过表达在体外对小鼠肝癌低淋巴道转移细胞株Hca-P生长、体外迁移和侵袭能力的影响。方法:构建CLIC1过表达真核载体pcDNA3.1(+)-CLIC1表达质粒,将重组的pcDNA3.1(+)-CLIC1基因和空载体pcDNA3.1(+)转染Hca-P母系细胞,通过G418筛选获得稳定表达CLIC1基因的pcDNA3.1(+)-CLIC1-Hca-P细胞株和转染空载体的pcDNA3.1(+)-Hca-P细胞株,RT-PCR和ELISA鉴定CLIC1过表达水平,CCK-8法检测细胞活力和分裂增殖能力,Transwell实验检测细胞的体外迁移能力和侵袭能力。结果:成功建立了稳定表达CLIC1基因的细胞株pcDNA3.1(+)-CLIC1-Hca-P,与空载体对照组相比,pcDNA3.1(+)-CLIC1质粒转染入Hca-P细胞后CLIC1基因表达水平显著升高。pcDNA3.1(+)-CLIC1-Hca-P细胞增殖明显高于Hca-P母系细胞组和空载体对照组,差异有统计学意义(P<0.05),且细胞增殖主要集中在72～96 h;Transwell检测各组肿瘤细胞迁移能力结果显示,pcDNA3.1(+)-CLIC1-Hca-P、pcDNA3.1(+)-Hca-P和Hca-P细胞株迁移到膜下和小室下室的平均细胞数分别为205.43±22.87、132.72±20.45和121.35±19.64。pcDNA3.1(+)-CLIC1-Hca-P与Hca-P、pcDNA3.1(+)-Hca-P细胞株比较差异有统计学意义(P<0.05);Transwell检测各组肿瘤细胞侵袭能力结果显示,pcDNA3.1(+)-CLIC1-Hca-P细胞穿过基膜的细胞数为(76.2±4.62)个,明显多于pcDNA3.1(+)-Hca-P的穿膜细胞数(48.34±3.45)个和Hca-P细胞的穿膜细胞数(49.8±5.51)个,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:CLIC1过表达可以显著促进Hca-P细胞增殖、增强其侵袭能力。CLIC1有望成为临床治疗肝癌的基因治疗靶点之一。
- 王梅宋波王波唐建武
- 关键词：肝肿瘤
- pCDNA3.1-Annexin A7载体的构建及在Hca-p细胞中的表达被引量：6
- 2008年
- [目的]构建pCDNA3.1-Annexin A7载体并稳定转染Hca-p细胞。[方法]提取小鼠总RNA,逆转录成cD-NA,PCR扩增,获取Annexin A7 CDS,将PcDNA3.1(+)质粒和Annexin A7 CDS片段行BamH I和EcoR I双酶切,构建并抽提pCDNA3.1-Annexin A7质粒,测序鉴定后转染Hca-p细胞,经400μg/mL G418完全培养基筛选获得pCDNA3.1-Annexin A7载体稳定转染的Hca-p细胞,在蛋白质水平检验Annexin A7的表达并行基因组DNA鉴定。[结果]成功构建pCDNA3.1-Annexin A7载体,经测序鉴定,所得到的载体中的CDS经比对与库中序列一致。pCDNA3.1-Annexin A7载体转染Hca-p细胞后,获得稳定上调表达Annexin A7的Hca-p细胞株;行基因组DNA鉴定,证实pCDNA3.1-Annexin A7已转入Hca-P细胞中,western-b lotting结果显示转染前后蛋白的表达相对值Annexin A7/GAPDH分别为0.43544±0.0112和0.45957±0.0065(P<0.05)。[结论]pCDNA3.1-An-nexin A7的构建并稳定转染Hca-p细胞成功,为通过上调Annexin A7在Hca-P的表达以证实Annexin A7与恶性肿瘤淋巴道转移潜能关系的相关研究打下了基础。
- 王志强唐建武王绍青孙成荣王波
- 关键词：PCR转染肿瘤淋巴道转移
- 烯酯酰辅酶A水解酶1生物学特性及其与肿瘤的关系被引量：1
- 2010年
- 烯酯酰辅酶A水解酶1（Ech1）是脂肪酸β氧化的关键酶，主要位于过氧化物酶体和线粒体。近年来研究表明，其表达异常与肝癌、胃癌、慢性淋巴细胞白血病等肿瘤有关，但具体作用机制不清楚。Ech家族其他成员与临床疾病的关系也非常密切。
- 张军唐建武
- 关键词：肿瘤生物学
- 膜联蛋白A7表达稳定下调的小鼠肝癌Hca-F细胞株的建立被引量：6
- 2008年
- 目的:建立针对膜联蛋白A7(annexin A7)的shRNA(small hairpin RNA)稳定转染的小鼠肝癌细胞株Hca-F,为后续研究奠定基础。方法:构建3条针对annexin A7的shRNA(shRNA1、2、3) ,分别与pSilencer连接,构建表达载体并分别转染Hca-F细胞,在mRNA和蛋白质水平比较3条shRNA对annexin A7表达的抑制作用,筛选抑制效果最好的shRNA转染Hca-F。稳转后用含400μg/ml G418的完全培养基筛选,获得annexin A7表达稳定下调的Hca-F细胞株后传代扩增,应用Western印迹法检测Hca-F细胞annexin A7蛋白的表达,并与空载体转染组及正常对照组进行比较。结果:经DNA测序鉴定,所得到干扰序列与GenBank中序列一致;筛选出其中shRNA1对annexin A7的表达抑制效果最好。pSilencer-shRNA1转染Hca-F细胞株后,annexin A7蛋白的表达远低于空载体转染组和正常对照组(0.3186 vs 0.7987 ,0.824 3,P<0.05) ,而后二者间无统计学差异。结论:成功建立了annexin A7表达稳定下调的小鼠肝癌Hca-F细胞株,为后续研究奠定了基础。
- 王志强唐建武王绍青孙成荣王波
- 关键词：RNA干扰转染肝肿瘤淋巴转移
- 烯酯酰辅酶A水解酶1过表达对小鼠低淋巴道转移潜能肝癌细胞株Hca-P生物学行为的影响被引量：2
- 2013年
- 目的探讨烯酯酰辅酶A水解酶1（Eehl）过表达对小鼠低淋巴道转移潜能肝癌细胞株Hca-P体外增殖生长、迁移和侵袭能力的影响，及其Echl表达水平与肝癌淋巴道转移潜能的关系。方法将pcDNA3．1（＋）-Echl重组质粒和空载体pcDNA3．1（＋）分别稳定转染Hca-P细胞，通过半定量逆转录聚合酶链反应和酶联免疫吸附试验检测目的基因及其蛋白表达水平；在获得过表达Echl的P‰。细胞株和实验对照组P空载体细胞株后，采用CCK．8法检测细胞分裂增殖能力，Transwell迁移实验和Transwell侵袭实验评估Echl过表达对Hca-P细胞迁移和侵袭能力的影响。结果PEch1，组和P空载体组细胞中EchlmRNA相对表达水平分别为3．21±0．43和1．44±0．03，差异有统计学意义（P=0.029）。PEch1组、P空载体组和未经处理的Hca-P组（P组）细胞中Ecbl蛋白表达水平分别为0．140±0．005、0．088±0．003和0．078±0．006，差异有统计学意义（P〈0．05）。PEch1，组的细胞增殖能力明显高于P空载体组和P组（P〈0．05）。Transwell迁移实验显示，PEch1组、P空载体组和P组穿膜细胞数分别为（143．00±7．25）个、（95．73±3．88）个和（106．67±3．54）个，PEch1组与P空载体组和P组比较，差异均有统计学意义（均P〈0．05）。Transwell侵袭实验显示，PEch1组、P空裁体组和P组穿膜细胞数分别为（77．20±5．46）个、（46．34±4．35）个和（49．80±5．21）个，PEch1组与P空载体组和P组比较，差异均有统计学意义（均P〈0．05）。结论Ech1过表达可以显著促进Hca-P细胞增殖，增强其迁移和侵袭能力。Ech1有望成为临床基因治疗肝癌的靶点之一。
- 王梅宋波王波张军唐建武
- 关键词：细胞迁移肿瘤转移
- 鼠肝癌淋巴道转移细胞模型的蛋白质组学研究被引量：8
- 2009年
- 对2株来源于同一亲本细胞但淋巴道转移力显著不同的小鼠肝癌腹水型细胞株Hca-F(淋巴结转移率75%)和Hca-P(淋巴结转移率25%),采用荧光差异双向凝胶电泳(2D DIGE)和DeCyder定量分析软件及HPLC-nESI-MS/MS技术,定量分析和鉴定了小鼠肝癌细胞Hca-F和Hca-P的差异表达蛋白.结果显示,有116个蛋白质点表达水平存在明显差异(p<0.05),在Hca-F中表达上调蛋白质点62个,下调蛋白质点54个.对所有116个蛋白质点进行了电喷雾串联质谱鉴定,共鉴定出109种单一(Unique)蛋白.其中部分蛋白已被报道与不同类型肿瘤的发生、浸润和转移相关,多数蛋白质被首次报道与肝癌的淋巴道转移过程直接相关.
- 孙明忠刘淑清唐建武
- 关键词：肝癌淋巴结转移
- shRNA稳定转染抑制氯离子通道蛋白1基因的表达对小鼠肝癌细胞的影响被引量：4
- 2010年
- 目的将shRNA稳定转染至小鼠肝癌细胞株Hca-F中,使得氯离子通道蛋白1(CLIC1)基因表达抑制,观察肿瘤细胞的增殖、细胞周期、凋亡情况以及迁移能力的变化。方法设计并合成理论上最佳的shRNA序列,进而将其插入pGPU6/GFP/Neo质粒中,经测序和双酶切验证载体构建成功后以梭华-Sofast将DNA质粒稳定转染至小鼠肝癌细胞株Hca-F中,经Real-timeRT-PCR验证CLIC1mRNA表达下调后,应用CCK-8试剂盒和流式细胞仪检测干扰前后的Hca-F细胞,对比观察细胞的增殖、细胞周期和凋亡情况的变化,应用Transwell小室检验其迁移能力的变化。结果 pGPU6/GFP/Neo-shRNA对CLIC1mRNA抑制效果明显,抑制率达57%。经该表达质粒的干扰后,Hca-F细胞的增殖能力明显增强,停留于G2/M期的细胞明显增多,凋亡细胞显著减少,Transwell小室中穿膜细胞数量明显减少。结论 CLIC1基因具有抑制小鼠肝癌细胞的增殖和促进其凋亡的作用,并且参与细胞周期中G2/M期的调节,同时能够促进肿瘤细胞的迁移。
- 李荣宽唐建武张军张宇虹王绍清王波王梅李妙玲陈文静金艳玲王静文魏元怡
- 关键词：细胞增殖细胞运动RNA小鼠
- 血管内皮生长因子比值在胃癌及转移中的变化及意义被引量：4
- 2012年
- 胃癌转移早期以淋巴系统转移为主，淋巴结转移的程度和范围是决定其预后的重要因素。血管内皮生长因子（vascularendothelialgrowthfactor，VEGF）-C和VEGF-D是特异性淋巴管生成调节因子，以往研究较多关注胃癌中VEGF-C、VEGF-D各自的表达情况，但对于VEGF-C／VEGF-D比值在胃癌及转移灶中的情况及其与淋巴道转移的相关性还不十分清楚，国内外鲜见报道。因此，深入探讨VEGF-C／VEGF-D比值与胃癌淋巴系统转移的关系，将有助于早期发现胃癌淋巴结转移和胃癌预后评估指标。
- 王静文唐建武王波侯力张军金燕玲王朔李荣宽
- 关键词：血管内皮生长因子胃癌转移VEGF-DVEGF-C淋巴系统淋巴管生成
- 胞内氯离子通道蛋白1基因沉默对小鼠肝癌细胞株增殖及侵袭能力的影响被引量：6
- 2010年
- 目的合成和筛选有效抑制细胞内氯离子通道蛋白1（CLIC1）基因的shRNA序列，构建表达质粒，并进一步研究CLIC1基因的表达被抑制后小鼠肝癌细胞株Hca-F细胞增殖及侵袭能力的变化。方法设计并合成3条理论上最佳的siRNA序列，进而将相应的双链DNA插入pGPU6／GFP／Neo质粒中，以脂质体Lipofectamine2000将DNA质粒稳定转染至小鼠Hca-F细胞中，收取细胞进行逆转录多聚酶链反应分析各组的CLIC1 mRNA表达水平，选出最佳干扰序列。应用细胞计数试剂盒检测最佳干扰序列表达质粒稳定转染的Hca-F细胞，对比观察其干扰前后增殖情况的变化；应用transwell小室检测其侵袭能力的变化。对研究数据应用统计学软件SPSS13．0进行方差分析。结果靶向CLIC1 mRNA的3个shRNA重组质粒载体经测序分析，shRNA编码序列与设计的片段完全一致。经酶切凝胶电泳证实载体构建成功。稳定转染pGPU6／GFP／Neo-shRNA-3表达质粒的Hca-F细胞对其CLIC1 mRNA抑制效果明显，抑制率达42．4％。经该表达质粒的干扰后，Hca—F细胞的增殖能力明显增强，侵袭能力显著下降，空白对照组、无关序列处理组、shRNA干扰组的穿膜细胞个数分别为98．93±5．00、96．27±2．60、50．73±3．89，P值均〈0．01。结论pGPU6／GFP／Neo-shRNA-3表达质粒能高效地抑制小鼠Hca-F细胞中CLIC1 mRNA的表达，CLIC1基因具有抑制小鼠肝癌细胞的增殖和促进其侵袭的作用。
- 李荣宽唐建武张军王绍清王梅王波张宇宏
- 关键词：增殖RNA干扰氯化物通道
