国家自然科学基金(30170952)
- 作品数：5 被引量：7H指数：2
- 相关作者：李立文王臻苏明权于文彬杨旻更多>>
- 相关机构：第四军医大学西京医院温州医学院附属第二医院更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金更多>>
- 相关领域：医药卫生更多>>
- 成骨细胞复合去抗原异种松质骨再造骨组织的实验研究被引量：2
- 2006年
- 目的:用胶原修饰去抗原牛松质骨载体表面,与成骨细胞复合进行体内异体移植,观察体内成骨效果,探讨其临床应用价值。方法:新鲜牛松质骨经脱脂、H2O2浸渍及部分脱钙处理,制成去抗原牛松质骨载体(antigen-extracted massive bovine cancellous bone carrier,MBC)。载体表面经胶原处理后,与兔骨膜成骨细胞复合后体外共同培养,4 w后将复合材料进行异体桡骨移植,于移植后2 w、 4 w、8 w和16 w取材,经HE染色观察。结果:植入2 w时,复合材料表面及孔内有成骨组织细胞黏附生长,材料周围可见大量软骨细胞分化,炎症反应不明显;4 w时有新骨成熟成岛状分布;8 w时有骨板形成;到16 w时,骨缺损就已完全修复,MBC部分降解,但在新骨中仍能见到残留体。结论:MBC载体表面经胶原处理后与成骨细胞的生物相容性更强,该材料复合成骨细胞后移植显示出了良好的骨诱导性和成骨活性及生物可降解性,有一定的临床应用价值。
- 彭磊胡蕴玉薛恩兴
- 关键词：成骨细胞胶原动物实验
- 使用hTERT启动子实现肿瘤特异性RNA干扰
- 2005年
- 目的:修饰hTERT核心启动子,构建shRNA表达载体,实现肿瘤特异性RNA干扰。方法:使用人工TATA盒修饰hTERT核心启动子,重建转录起点。将含有修饰后hTERT启动子的MluI/XhoI片段克隆至pGL3-OCP-shLuc的相应酶切位点,获得pGL3-mhTERT-shLuc。设计针对p53的shRNA编码序列,并以XhoI/XbaI克隆至pGL3-mhTERT-shLuc的相应酶切位点之间,获得pGL3-mhTERT-shp53。使用pGL3-mhTERT-shLuc与pGL3-control共转染人骨肉瘤细胞U2OS、MG-63和HOS,48h后测定虫荧光素酶活性,计算相对活性。使用pGL3-mhTERT-shp53不同的人骨肉瘤细胞,利用Western Blot分析转染前后p53的表达水平。结果:双酶切鉴定和DNA测序证实pGL3-mhTERT-shLuc和pGL3-mhTERT-shp53的序列与设计完全一致。pGL3-mhTERT-shLuc与pGL3-control共转染实验发现,在hTERT-U2OS细胞虫荧光素酶相对活性与对照组相比没有明显差异,而在hTERT+的MG-63和HOS细胞在转染后虫荧光素酶相对活性显著降低,与对照组相比抑制效率可分别达到69.7%和71.0%。Western Blot分析表明,与转染pGL3-mhTERT相比,使用pGL3-mhTERT-shP53转染MG-63和HOS后可显著抑制p53的表达,而U2OS的p53的表达水平与对照组没有明显改变。结论:我们成功使用TATA盒对hTERT核心启动子进行了修饰,利用其构建了shRNA表达?
- 李立文胡蕴玉舒茂国王臻郭树忠郭晓彤
- 关键词：RNA干扰荧光素酶骨肉瘤
- 长双链RNA非特异性诱导人骨肉瘤细胞凋亡的实验研究被引量：2
- 2004年
- 目的通过构建能产生长双链RNA的质粒载体,探讨长双链RNA非特异性诱导人骨肉瘤细胞凋亡的可行性。方法以无毒性、完全外源性基因绿色荧光蛋白EGFP基因为RNA模板,使用2个启动子同时从正反向引导DNA序列产生正义和反义链RNA,构建产生长双链RNA的质粒载体。转染人骨肉瘤细胞系MG63,48h后对细胞进行凋亡荧光染色、流式细胞仪及MTT法测定,对数据进行统计学处理。结果成功获得能产生长双链RNA的质粒载体pCI-neo-dsEGFP,MTT法测定显示随着pCI-neo-dsEGFP质粒剂量的增加(0.05μg,0.10μg,0.15μg,0.20μg,0.25μg,0.30μg),细胞的吸光度逐渐减小。转入pCI-neo-dsEGFP组的MG63细胞经凋亡荧光染色呈现大量绿色不规则荧光,出现凋亡现象,而对照组没有出现。流式细胞仪检测结果显示阴性对照组MG63细胞凋亡率为0.028±0.006;pCI-neo-dsEGFP质粒剂量1.0μg时MG63凋亡率为0.175±0.021;2.0μg时凋亡率为0.348±0.032;3.0μg时凋亡率为0.381±0.027;阳性对照组MG63细胞凋亡率为0.386±0.029。随着dsRNA剂量的增加,骨肉瘤细胞生长的抑制效应逐渐增加。当pCI-neo-dsEGFP质粒剂量为3.0μg时,对MG63细胞产生的凋亡效应与100 μl的5-FU(50μg/ml)产生的凋亡效应差异无显著性。结论长双链RNA能非特异性诱导人骨肉瘤细胞发生凋亡,
- 王臻杨旻李立文苏明权于文彬
- 关键词：骨肉瘤基因表达调控质粒载体
- 构建MYC反应元件修饰hTERT核心启动子引导Fcy1表达的腺病毒载体
- 2002年
- 目的 构建串联的 MYC反应元件修饰人端粒酶逆转录酶 (h TERT)核心启动子引导酵母胞嘧啶脱氨酶基因Fcy1表达的复制缺陷型腺病毒载体 .方法 将串联的 MYC反应元件修饰的 h TERT核心启动子及下游酵母胞嘧啶脱氨酶基因 Fcy1克隆到穿梭质粒 p DC316上 ,与辅助质粒 p BH-Glox(delta) E1,3Cre共转染 HEK2 93细胞获得重组复制缺陷型腺病毒并在 HEK 2 93细胞中扩增重组病毒 . PCR法及斑形成实验鉴定重组腺病毒和病毒滴度 .结果 成功获得由6倍和 18倍 MYC反应元件修饰 h TERT核心启动子引导Fcy1基因表达的复制缺陷型腺病毒载体 .结论 MYC反应元件修饰 h TERT核心启动子引导 Fcy1基因表达的腺病毒载体为进一步研究骨肉瘤转录靶向基因治疗奠定了基础 .
- 杨旻王臻李立文苏明权于文彬
- 关键词：HTERT腺病毒载体肿瘤
- 构建由缺氧反应元件修饰的hTERT核心启动子引导FCY1基因表达的复制缺陷型腺病毒被引量：3
- 2002年
- 目的 构建由缺氧反应元件串联重复体修饰的人端粒酶逆转录酶 (h TERT)核心启动子引导酵母胞嘧啶脱氨酶FCY1基因表达的复制缺陷型重组腺病毒 .方法 人工设计缺氧反应元件串联重复序列 ,克隆后插入 h TERT启动子上游并经测序证实 .将修饰后的 h TERT启动子和酵母胞嘧啶脱氨酶基因 FCY1插入穿梭质粒 ,与辅助质粒共转染 HEK2 93细胞 ,重组产生复制缺陷型腺病毒 .结果 获得了由 3倍和 6倍缺氧反应元件修饰的 h TERT核心启动子引导 FCY1基因表达的复制缺陷型重组腺病毒 .结论 基于 Cre重组酶 / lox P的腺病毒载体构建系统操作简便。
- 李立文王臻苏明权马越云于文彬杨旻李哲
- 关键词：反应元件端粒末端转移酶腺病毒科
