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国家重点基础研究发展计划(2010CB530200): 作品数：40 被引量：105H指数：6; 相关作者：高剑峰李建华陈创夫陈月娥马润林更多>>; 相关机构：石河子大学中国疾病预防控制中心传染病预防控制所中国科学院遗传与发育生物学研究所更多>>; 发文基金：国家重点基础研究发展计划国家自然科学基金国际科技合作与交流专项项目更多>>; 相关领域：农业科学医药卫生生物学更多>>

新疆4个绵羊品种内皮型一氧化氮合酶基因第8外显子的PCR-SSCP鉴定被引量：1: 2015年; 目的:对新疆4个绵羊品种内皮型一氧化氮合酶(eNOS)基因第8外显子的多态性进行鉴定。方法:利用PCR-SSCP和测序的方法对76只中国美利奴羊、51只无角陶赛特羊、57只萨福克羊、37只哈萨克羊共4个绵羊品种进行单核苷酸多态性(SNP)检测,并用生物信息学方法对检测出的SNP进行统计分析。结果:在中国美利奴羊、无角陶赛特羊、萨福克羊、哈萨克羊中共检测到AA、AB、BB等3种基因型,AA基因型的频率分别为0.0526、0.0980、0.1754和0.2973,BB基因型的频率分别为0.6316、0.1961、0.5614和0.1892,AB基因型的频率分别为0.3158、0.7059、0.2632和0.5135。通过测序,在eNOS基因第8外显子上发现了一个新的SNP位点(ss974768653),位于绵羊eNOS基因第8外显子142 bp处(A142G)。结论:中国美利奴羊和哈萨克羊的多态性位点(P>0.05)处于Hardy-Weinberg平衡状态,萨福克和无角陶赛特羊的多态性位点(P<0.05)不处于Hardy-Weinberg平衡状态。; 李建华许万云胡梦薇汪文伦高剑峰; 关键词：绵羊内皮型一氧化氮合酶 PCR-SSCP 单核苷酸多态性外显子

中国美利奴绵羊MHC 222G18 BAC克隆的基因筛选与结构分析: 2011年; 绵羊主要组织相容性复合体(MHC)是与控制绵羊抗病性和易感性紧密连锁的基因簇。为了深入了解该类基因的组成与结构,利用中国美利奴绵羊细菌人工染色体(BAC)文库MHC区段克隆222G18,经BsaJⅠ酶切后制备α-32P放射性探针,通过噬菌斑原位杂交技术筛选中国美利奴绵羊cDNA文库,经过两轮杂交筛选,获得12个cDNA阳性克隆,经测序、比对等生物信息学分析确定获得7条与免疫相关的序列,其中3条具有完整的编码序列。利用SIM4软件将7条序列定位到BAC克隆上,结果显示绵羊MHC区段的表达序列多为断裂基因且跨度很大,可能是形成其基因多样性的重要原因之一。; 邱巍董慧芹白大章陈芳马润林高剑峰; 关键词：主要组织相容性复合体细菌人工染色体 CDNA文库

中国美利奴羊TLR4基因多态性的PCR-SSCP鉴定被引量：1: 2017年; 为了研究中国美利奴羊TOLL样受体(TLR4)基因第3外显子上的单核苷酸多态性(SNPS)和单氨基酸多态性(SAPS)。利用生物信息学方法对NCBI上公布的有关绵羊的TLR4序列进行下载并用Seq Man对下载的绵羊TLR4基因外显子进行多态性比对分析,然后采用PCR-SSCP并结合测序的方法对119只中国美利奴羊TLR4基因的外显子3的扩增片段进行分析。通过分析发现,在中国美利奴羊第3外显子1 180 bp处有1个突变位点,由G突变成T,氨基酸由天冬氨酸(D)变成酪氨酸(Y),即该位点为有义突变。在1 537 bp处也有1个突变位点,即由G突变成了A,氨基酸由丙氨酸(A)变成苏氨酸(T),在TLR4第3外显子的其他位点并没有SNPS位点,说明中国美利奴羊TLR4基因上的第3外显子区域有2个多态位点。; 王会敏罗成齐江姣王元元李村院高剑峰; 关键词：中国美利奴羊多态性生物信息学方法 PCR-SSCP 外显子突变位点

TaqMan MGB探针实时荧光定量-聚合酶链反应检测人粒细胞无形体Msp2基因方法的建立被引量：4: 2012年; 目的建立敏感、特异、实时荧光定量-聚合酶链反应(real-time fluorescence quantitative,FQ-PCR)方法,用于人粒细胞无形体病的检测。方法根据无形体特异外膜蛋白Msp2基因为靶基因设计引物以及TaqMan MGB探针,建立FQ-PCR方法,并对湖北省随州和河北省张家口地区的蜱标本进行了检测。结果本研究建立的TaqMan MGB探针具有良好的特异性,建立的FQ-PCR标准曲线的循环阈值(Ct)与模板拷贝数呈良好的线性关系(r=0.99),灵敏性评估发现每个20μl PCR反应管中只要有35个拷贝的目的基因即可被检测到,即最低检出浓度为2拷贝/μl,并且具有较好的重复性。共检测蜱标本426只,其中豪猪血蜱253只,共49组,阳性7份。结论本研究建立的FQ-PCR方法具有很高的特异性和敏感性,可用于人粒细胞无形体感染的快速检测。进一步证实了豪猪血蜱可能是粒细胞无形体的媒介宿主。; 付秀萍王景泉贺金荣张景山; 关键词：人粒细胞无形体 REAL-TIME PCR

中国美利奴羊MHC-DRB1基因exon2 SNPs及其与布鲁氏菌病易感性相关性被引量：15: 2014年; 通过PCR扩增126只布鲁氏菌阴性和67只布鲁氏菌阳性中国美利奴羊MHC-DRB1基因exon2,产物经SSCP电泳检测单核苷酸多态性(SNPs),而后对不同等位基因进行克隆测序,旨在确定该基因exon2多态位点,并对每个SNP位点的等位基因频率、基因型频率进行差异统计分析,从而分析其与布鲁氏菌病易感性的相关性。结果表明:在270 bp的序列内共检测到41个SNPs,其中109 C>T位点的等位基因在病例-对照样本中的分布存在显著差异(P<0.05)。由此表明,MHC-DRB1 exon2多态性与绵羊种布鲁氏菌病易感性显著相关。; 陈月娥苟亚峰周路马慧王丹高剑峰; 关键词：SNPS 布鲁氏菌病易感性中国美利奴羊

实时定量PCR检测siRNA对小鼠巨噬细胞中FTH1基因表达的抑制作用被引量：1: 2010年; 目的通过实时定量PCR(real-ti me PCR)检测基因表达的mRNA,建立一种直接观察小干扰RNA(si RNA)抑制目的基因表达的方法。方法化学设计合成对应于FTH1(ferritin heavy chain1,FTH1)基因表达mRNA的si RNA,经TurboFectTMin vitro Transfection Reagent转染小鼠RAW264.7巨噬细胞,48h后,提取总RNA,逆转录为cDNA。以3-磷酸甘油醛脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)为内参,定量检测FTH1的表达,比较干扰前后FTH1基因mRNA的量。结果 3种si RNA处理的小鼠巨噬细胞中FTH1基因的表达抑制率最高为97.60%。结论实时定量PCR方法的建立为研究布鲁氏菌在侵染巨噬细胞过程中FTH1的功能提供了有效途径。; 杜军伟王远志陈创夫葛阳春唐利燕; 关键词：实时定量PCR SIRNA

绵羊DRA基因外显子2酵母表面展示库的构建及鉴定被引量：3: 2016年; 根据绵羊DRA基因序列和酿酒酵母表面展示载体pYD1上的多克隆位点设计特异性引物,从绵羊组织中提取总RNA并逆转录,利用PCR技术扩增得到DRA基因,克隆获得762bp目的片段,并提交GenBank,登录号:KR422362。将该基因通过双酶切连接到表面展示载体pYD1上,成功构建了酿酒酵母表面展示重组质粒pYD1-DRA。将DRA基因外显子2两端进行基因点突变,形成新的酶切位点,继而对外显子2设计特异性引物,对绵羊大样本进行DNA池化,并将外显子2扩增产物测序,分析其多态性获得多态位点。重组质粒双酶切得到246bp具有多态性的外显子2,将其连接到经同样酶双酶切的表面展示重组突变载体pYD1-DRA-TB上,成功构建了酿酒酵母表面展示库。将其转化用于表面展示的酿酒酵母EBY100感受态细胞中,得到酵母转化子,挑取酵母菌的单克隆通过PCR扩增及序列测定证实了DRA基因库已成功整合到酿酒酵母基因组中。经半乳糖诱导后,通过免疫荧光法在荧光显微镜下检测得到DRA基因库已成功展示在酵母细胞表面。; 许万云王会敏汪文伦胡梦薇严国李建华高剑峰; 关键词：绵羊 DRA 外显子2 点突变免疫荧光法

TaqMan-MGB探针实时荧光定量PCR检测恙虫病东方体方法的建立被引量：5: 2012年; 目的建立敏感、特异、定量Real-time PCR方法,用于恙虫病东方体的检测。方法根据恙虫病东方体56 kD外膜蛋白基因序列设计引物和探针,建立实时荧光定量PCR检测方法。结果建立的TaqMan-MGB探针具有良好的特异性,建立的荧光定量PCR标准曲线的循环阈值(Ct)与模板拷贝数呈良好的线性关系(r=0.99),灵敏性评估发现每个20μlPCR反应管中只要有26个拷贝的目的基因即可被检测到,即最低检出浓度为2拷贝/μl,并且具有较好的重复性。结论建立的荧光定量PCR方法具有很高的特异性和敏感性,可用于恙虫病东方体感染的快速检测。; 付秀萍贺金荣张景山王景泉; 关键词：恙虫病东方体实时荧光定量PCR TAQMAN-MGB探针

中国美利奴羊内皮型一氧化氮合酶基因3个外显子多态性的PCR-SSCP鉴定: 2014年; 本试验旨在研究中国美利奴羊内皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase,eNOS)基因第7、13、14外显子上的单核苷酸多态性(SNPs)和单氨基酸多态性(SAPs)。利用生物信息学方法对人、小鼠和中国美利奴羊eNOS基因上的第7、13、14外显子进行了相似性比较,并对GenBank SNP数据库上已公布的人和小鼠eNOS基因外显子多态性进行了统计分析,然后采用PCR-SSCP方法对120只中国美利奴羊eNOS基因的这3个外显子的扩增片段进行分析,通过分析发现在120只中国美利奴羊这3个外显子上并没有SNPs位点,说明中国美利奴羊eNOS基因上的这3个外显子区域相对保守。; 李建华周路刘朋涛王文文朱军保汪文伦高剑峰; 关键词：中国美利奴羊内皮型一氧化氮合酶基因 PCR-SSCP 多态性

Identification of immunoreactive proteins of Brucella melitensis by immunoproteomics被引量：12: 2011年; Infection with Brucella causes brucellosis, a chronic disease in humans, which induces abortion and sterility in livestock. Among the different Brucella species, Brucella melitensis is considered the most virulent and is the predominant species associated with outbreaks in China. To date, no safe human vaccine is available against Brucella infection. The currently used live vaccines against Brucella in livestock induce antibodies that interfere with the diagnosis of field infection in vaccinated animals, which is harmful to eradication programs. However, there is as yet no complete profile of immunogenic proteins of B. melitensis. Towards the development of a safer, equally efficacious, and field infection-distinguishable vaccine, we used immunoproteomics to identify novel candidate immunogenic proteins from B. melitensis M5. Eighty-eight immunoreactive protein spots from B. melitensis M5 were identified by Western blotting and were assigned to sixty-one proteins by mass spectrometry, including many new immunoreactive proteins such as elongation factor G, F0F1 ATP synthase subunit beta, and OMP1. These provide many candidate immunoreactive proteins for vaccine development.; ZHAO ZhongPengYAN FangJI WenHuiLUO DeYanLIU XinXING LiDUAN YueQiangYANG PengHuiSHI XiuMinLI ZhongWANG XiLiang; 关键词：布鲁氏杆菌蛋白鉴定免疫蛋白布氏杆菌病

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