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副猪嗜血杆菌黑龙江株的分离与鉴定被引量：9: 2011年; 为确定黑龙江某猪场发病猪群的病原,本研究从疑似浆膜炎的病料中分离到一株革兰氏阴性细小杆菌,通过对其进行细菌形态学、培养特征、生化特性和16S rRNA基因PCR鉴定,结果表明该分离菌株为副猪嗜血杆菌(HLJ-1分离株)。16S rRNA基因序列分析结果显示:该分离菌株与参考株的基因同源性达99%;药敏试验结果表明HLJ-1分离株对头孢曲松、头孢噻肟等β-内酰胺类抗生素高度敏感;小白鼠致病性试验结果显示,该分离株具有较强致病性。; 李雪松陈欣符芳王伟田华彬郎越坤徐春红李曦李春艳; 关键词：副猪嗜血杆菌 RRNA基因

TTV1与TTV2 SYBR-Green I实时荧光PCR检测方法的建立和应用被引量：9: 2010年; 为建立输血性传播病毒(TTV)基因1型(TTV1)和TTV基因2型(TTV2)的检测方法,本研究根据TTV1与TTV2基因的非编码区域序列差异,设计了2对特异引物,建立了鉴别TTV1和TTV2的SYBR-GreenⅠ实时荧光PCR方法。分别进行了特异性、敏感性及重复性检验,结果表明:重组质粒建立的标准曲线相关系数为99%;可以同时鉴别检测TTV1和TTV2,检测PCV2和PRRSV阳性样品均呈阴性,表明该方法具有良好的特异性;最低检出量为10 copies/μL;重复试验结果显示,TTV1组内和组间变异系数分别为0.14%和0.74%;TTV2组内和组间变异系数均为0.13%;检测现地采集的189份样品,TTV1阳性率32.3%,TTV2阳性率6.3%,TTV1和TTV2混合感染的阳性率28.6%。TTV检测方法的建立为猪群TTV病的流行病学调查提供了有效的手段。; 陈欣符芳王伟李雪松李海忠宋淑萍李曦

猪瘟病毒野毒株与疫苗株双重SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法的建立被引量：10: 2010年; 为建立猪瘟病毒(CSFV)兔化弱毒疫苗(C株)与野毒株的快速鉴别检测方法,本研究根据GenBank登录的CSFV C株与野毒株的E2基因序列差异,设计2对特异性引物,建立了同时检测C株与野毒株的双重SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法。应用该方法对CSFV野毒和疫苗株的最低检出量为10拷贝;检测牛病毒性腹泻病毒Ⅰ型、猪繁殖与呼吸综合征病毒、伪狂犬病病毒和猪圆环病毒2型4种病毒均呈阴性;批内、批间重复试验的变异系数均低于3%。应用该方法检测从黑龙江省各地区猪场采集的600份样品,结果表明野毒株的阳性率为30.5%。该方法可应用于CSFV野毒株和C株的鉴别检测。; 王伟符芳陈欣李雪松李海忠李曦; 关键词：猪瘟病毒野毒株 C株

猪圆环病毒2型衣壳蛋白(Cap)在293T细胞中的亚细胞定位被引量：4: 2010年; 猪圆环病毒2型(PCV2)ORF2基因编码病毒的核衣壳蛋白(Cap),该蛋白属于病毒保护性抗原,具有重要免疫功能。本研究以PCV2871毒株基因组为模板,用特异性上下游引物扩增获得ORF2基因,利用真核表达载体构建了表达PCV2Cap蛋白的重组质粒pCAGGS-ORF2。采用脂质体将pCAGGS-ORF2转染至293T细胞,用抗PCV2-Cap单克隆抗体对重组质粒转染细胞进行了免疫活性分析和免疫荧光检测,表明Cap蛋白在细胞中获得表达;利用共聚焦显微镜对Cap蛋白在293T细胞中的亚细胞定位观察结果表明,转染24h后可见Cap蛋白的表达随培养时间延长显著增多,72h达到高峰,表达的Cap蛋白主要分布在细胞核中。构建的pCAGGS-ORF2真核表达重组质粒在293T细胞中的表达,为进一步PCV2基因疫苗的研制奠定了基础。; 符芳李曦李雪松李海忠陈欣王伟魏萍; 关键词：猪圆环病毒2型核衣壳蛋白亚细胞定位

副猪嗜血杆菌的分离鉴定及药敏试验: 副猪嗜血杆菌是寄居在猪上呼吸道的一种常见菌,可引起猪的格拉瑟氏病,发病时以纤维性多浆膜炎、脑膜炎、关节炎为主要症状。本实验从黑龙江某发病猪场疑似病例中分离到一株,经过生化及16sRNA鉴定其为副猪嗜血杆菌,并经对其tbp...; 陈欣符芳李雪松王伟李曦高学军; 关键词：副猪嗜血杆菌 PCR-RFLP 药敏试验; 文献传递

猪圆环病毒2型去核定位信号ORF2基因的原核表达与初步应用被引量：3: 2008年; 根据PCV2-871病毒株的已知序列设计一对引物,PCR扩增其去核定位信号的Cap基因(ORF2),通过BamHⅠ/HindⅢ双酶切位点将其克隆到表达载体pQE-32中,转化大肠杆菌M15。经IPTG诱导表达、SDS-PAGE鉴定,表明去核定位信号的Cap蛋白可以大量表达。Western blot、ELISA鉴定蛋白活性,继而,以重组蛋白为抗原包被ELISA板,对28份临床样品进行检测。结果表明,该蛋白具有良好的抗原活性,可以作为抗原应用于临床样品的检测。; 苗丽娟符芳王小武陈微晶鲁晶红李曦; 关键词：猪圆环病毒2型 CAP蛋白原核表达

高致病性猪生殖与呼吸综合征病毒感染猪外周血单核细胞cDNA文库的构建: 2009年; 为应用CloneminerTMcDNA Library Construction Kit构建高致病性猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)感染猪的外周血单核细胞cDNA文库,以1×105TCID50PRRSV肌肉接种健康猪,攻毒后第3、5、7、9、14、21及28 d分别采集感染猪外周血,分离单核细胞,提取总RNA、mRNA,以mRNA为模板,通过引物Biotin-attB2-Oligo(dT)、SuperScript.ⅡRT合成5′末端具有attB1接头的cDNA。用柱层析方法纯化cDNA,纯化后的cDNA与pDONRTM222载体进行BP重组,于大肠杆菌DH10B转化,进行文库容量测定。结果表明,构建的高致病性PRRSV感染猪外周血单核细胞cDNA文库的库容量为1.36×107CFU,平均插入片段长度大于1 200 bp,重组率为94.3%,为进一步从文库中筛选未知细胞因子及相关基因提供了有效的工具。; 肖晶符芳李海忠张永欣柴政蔡雪辉宋淑萍李曦; 关键词：猪生殖与呼吸综合征病毒外周血单核细胞 CDNA文库

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黑龙江省自然科学基金(ZJN0503-02)