国家自然科学基金(30700800)
- 作品数：8 被引量：15H指数：3
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- 大鼠GSK3β基因RNAi腺病毒载体的构建与鉴定及其对肝卵圆细胞增殖的促进作用
- 2012年
- 目的构建并鉴定特异性大鼠糖原合成酶激酶3β(GSK3β)基因siRNA腺病毒载体,观察其对肝卵圆细胞系WB-F344增殖的影响。方法用DNA重组技术将针对GSK3β基因不同部位所设计的2对shRNA序列克隆到高效RNAi真核表达质粒载体pGenesil-1.1中,构建shRNA表达载体pGenesil-1.1-GSK3β。分别酶切重组质粒及pDC312载体,转化连接,构建腺病毒载体pDC312-GSK3β,PCR扩增与鉴定。脂质体法介导腺病毒载体与骨架质粒pPE3-F11共转染293细胞,包装产生腺病毒颗粒AdD C3 12-GSK3β并测定滴度。取病毒上清感染WB-F34 4细胞,荧光显微镜观察细胞荧光含量,Western blotting检测GSK3β蛋白表达。CCK-8测定转染前后WBF-344增殖变化。结果经PCR酶切及Western blotting技术证实成功构建了针对大鼠GSK3β基因RNAi质粒pGenesil-1.1-GSK3β及GSK3β基因RNAi重组腺病毒载体AdDC312-GSK3β。Western blotting证实该重组腺病毒载体可抑制WBF-344细胞GSK3β的表达。CCK-8结果显示干扰GSK3β可促进WBF-344细胞增殖。结论成功构建了针对GSK3β基因RNAi的腺病毒载体,并在大鼠肝卵圆细胞系WBF-344中稳定表达,促进细胞增殖。
- 谢元康钟骏桥蒋磊季晓克郭旭张启瑜单云峰
- 关键词：GSK3ΒRNAI腺病毒肝卵圆细胞
- 大鼠糖原合成酶激酶3β过表达及糖原合成酶激酶3β抑制剂SB-216763对肝卵圆细胞增殖的影响
- 2012年
- 目的研究糖原合成酶激酶（GSK）3β过表达及GSK3β抑制剂SB-216763通过Wnt通路对大鼠肝卵圆细胞增殖的影响及其调控机制。方法肝卵圆细胞WBF-344分为空白对照组、GSK3β过表达慢病毒组（过表达组）、二甲基亚砜对照组和GSK3β抑制剂组，抑制剂组设1、5、10μmol／L3个浓度梯度。以鉴定正确的GSK3β过表达慢病毒和不同浓度SB-216763处理WBF-344细胞，相差及荧光显微镜分别观察细胞形态及慢病毒组细胞荧光表达量；CCK8检测细胞增殖，AnnexinV-碘化丙啶检测细胞凋亡；Western blot法检测GSK3β、β—catenin及cyclinD1蛋白表达。结果镜下见GSK3β过表达组细胞较少，老化明显，且出现大量绿色荧光；各抑制剂组细胞分裂旺盛，状态良好，且细胞数随SB-216763浓度升高而增多。CCK8及流式细胞术显示GSK3β过表达组细胞增殖减慢（t=7．178，P〈0．01），凋亡明显，抑制剂组增殖加快（F=45．030，P〈0．01）。Westemblot法显示过表达组GSK3β呈高表达趋势，p—catenin和cyclinD1表达减弱，抑制剂组GSK3β表达量无明显差别，但随抑制剂浓度增高，B—catenin和cyclinD1表达增强。结论GSK3β过表达可下调Wnt通路使细胞增殖减慢，促进凋亡。GSK3β抑制剂能激活Wnt通路促进细胞增殖。
- 钟骏桥谢元康季晓克符竣惠汪洋张启瑜施红旗单云峰
- 关键词：糖原合成酶激酶3吲哚类
- 大鼠糖原合成酶激酶-3β过表达基因慢病毒载体的构建与鉴定
- 2012年
- 糖原合成酶激酶-3β（Gsk-3β）是哺乳动物中广泛表达的丝氨酸／苏氨酸激酶，它不似能磷酸化糖原合成酶，促进糖代谢，还可磷酸化-系列底物，包括代谢相关蛋白、信号转导蛋白、结构蛋白和一些转录因子，并参与PI-3K、Wnt及Hedgehog等信号通路，影响细胞的生存与凋亡、运动与迁移及肿瘤的生成等。我们通过构建大鼠Gsk-3β基因过表达慢病毒载体并实现该基因在WBF-3β细胞中的稳定高表达。
- 谢元康单云峰钟骏桥季晓克郭旭陈桢坤施红旗余震张启瑜
- 关键词：糖原合成酶激酶-3Β基因过表达慢病毒载体HEDGEHOGGSK-3Β信号转导蛋白
- miR-21在大鼠肝卵圆细胞活化和增殖过程中作用研究被引量：4
- 2014年
- 目的 探讨miR-21调控肝卵圆细胞活化和增殖过程的可能机制.方法 采用2-乙酰氨基芴（2-AAF）/部分肝切除法诱导SD大鼠肝卵圆细胞活化模型,分别于0、6、12、24、72、168 h处死动物,同时以单纯肝切除的相应时间点作为对照,分别提取各标本RNA逆转录后行SYBR Green实时荧光定量PCR,检测各组miR-21的表达,行两样本t检验,并用生物信息学方法分析其调控的miRNA转录分子和靶基因.实时荧光定量PCR检测其靶基因表达,Westem blot法检测其靶基因蛋白表达,进行两样本均值的t检验,以P＜ 0.05为差异有统计学意义. 结果 成功建立大鼠肝卵圆细胞活化模型,检测miR-21的扩增信号,miR-21在实验组表达12h开始升高,24 h达到峰值,随后开始降低,168 h再次升高;而对照组6h开始升高,24h后开始下降后基本恢复原水平.实验组与对照组表达比较,实验组在6 h miR-21的表达低于对照组,t=3.029,P=0.039,差异有统计学意义;而在24 h和168 h的表达高于对照组,t值分别为-3.433、-5.105,P值均＜0.05,差异有统计学意义.根据三个数据库的综合评分,结合相关文献,我们选取Smad7为研究的靶基因.检测两组Smad7mRNA表达,对照组中在6h略有下降,后开始升高,在24 h达到峰值后开始下降恢复原水平;在实验组中,6h升高后至24 h达到峰值,随后开始降低,168 h又略有升高.对照组Smad7蛋白表达从6h开始降低,到24 h达到最低后开始升高;实验组6h升高,随后下降,168 h达到最低.Smad7 mRNA表达量变化趋势与miR-21表达变化趋势基本一致,Smad7蛋白表达和miR-21表达变化趋势呈负相关. 结论 成功建立SYBR Green实时荧光定量PCR检测大鼠miR-21的方法,证实miR-21在肝卵圆细胞活化与增殖中起重要作用,Smad7作为miR-21的靶基因可能参与这一过程.
- 陈桢坤单云峰何彬杨毅伍波季晓克王斯璐张启瑜
- 关键词：微小RNA-21肝卵圆细胞细胞活化
- 脱落酸对人胰腺癌细胞增殖的影响被引量：3
- 2013年
- 目的探讨脱落酸（ABA）对人胰腺癌细胞株（PANC-1）增殖的影响及其作用机制。方法细胞计数试剂盒（CCK-8）法筛选出ABA处理浓度，实验分为对照组和ABA处理组，处理组设3个处理浓度，0．001、0．010、0．100mmol／L。通过细胞形态观察、CCK-8法及膜联蛋白V／碘化丙锭（AnnexinV／PI）方法观察ABA对PANC-1增殖的影响。逆转录一聚合酶链反应（RT-PCR）及Western blot法分别检测端粒酶mRNA（hTERTmRNA）及半胱氨酰天冬氨酸特异性蛋白酶（Caspase）-3、B淋巴细胞／白血病12（bcl-2）、细胞周期素（Cyclin）D1蛋白的表达。结果ABA使细胞增殖减慢（24h：F=52．253，P〈0．01；48h：F=107．461，P〈0．01），促进凋亡（对照组和各处理组抑制率分别为4．26％、15．42％、22．02％、39．95％）。处理组hTERTmRNA表达下降，Caspase-3表达增强，bcl-2及Cyclin D1表达减弱，此效应随ABA浓度升高而明显。结论ABA能抑制PANC-1细胞增殖，促进凋亡，其机制是活化Caspase-3，降低hTERTmRNA及bcl-2、Cyclin D1蛋白的表达。
- 钟骏桥向俊峰尹航温超谢元康郭旭陈桢坤黄约翰张启瑜单云峰
- 关键词：胰腺癌脱落酸增殖脱噬作用
- 抑制PI3K／Akt信号通路对Ephrin—A1介导的肝癌细胞运动和侵袭能力的影响被引量：1
- 2009年
- 目的探讨PI3K／Akt信号传导通路在Ephrin—A1介导的肝癌细胞侵袭、转移过程中的作用。方法Western blot法检测Ephrin-A1／Fc融合蛋白作用人肝癌细胞系Huh-7细胞前后丝裂原激活的蛋白激酶（MAPK）和磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）信号分子的表达，利用LY294002特异性的阻断PI3K／Akt信号通路后，检测细胞运动能力、细胞侵袭能力的变化。结果Ephrin—A1／Fc融合蛋白作用后p-Akt磷酸化蛋白的表达与对照组比较明显上升（t=4．564，P〈0．05），PI3K／Akt信号通路可能为Ephrin—A1／EphA1作用的下游信号传导通路；LY294002明显抑制Ephrin—A1／Fc融合蛋白对Huh-7细胞中PI3K／Akt信号通路的激活，p-Akt磷酸化蛋白的含量与对照组比较明显减少（P〈0．05）；Ephrin-A1介导肝癌细胞的运动能力及侵袭能力明显受到抑制（P〈0．05）。结论PI3K／Akt信号通路在Ephrin—A1介导的肝癌细胞侵袭、转移过程中起重要的作用。
- 陈钢王怡周蒙滔施红旗余正平朱椰凡俞富祥单云峰
- 关键词：信号传导
- β-catenin在肝卵圆细胞中的表达及意义被引量：7
- 2008年
- 目的:研究β-catenin在肝卵圆细胞中的表达和意义。方法:利用2-乙酰氨基芴/部分肝切除(2-AAF/PH)建立肝卵圆细胞活化的大鼠模型,利用免疫组化方法研究其中β-catenin和CycinD1表达情况。结果:β-catenin主要表达于肝细胞的细胞膜上,但在肝卵圆细胞,可见胞浆和胞核均有β-catenin的表达。CycinD1只表达于肝卵圆细胞,而肝细胞未见表达,且CycinD1主要定位于细胞核上。讨论:WNT信号途径也参与了肝卵圆细胞活化的过程,和肝卵圆细胞的增殖和分化相关。
- 王磊单云峰施红旗张启瑜
- 关键词：肝细胞Β-CATENIN
- 野生型Parkin基因对肝癌细胞生长的影响
- 2010年
- 目的 探讨野生型及突变型Parkin基因表达对人肝癌细胞株Huh-7在体内外生长情况的影响.方法 利用脂质体介导的基因转染法将野生型及突变型Parkin基因真核表达载体转染肝癌细胞株Huh-7,筛选稳定表达细胞株,通过逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）进行鉴定并送测序分析.细胞增殖实验和裸鼠致瘤性实验检测各稳定表达株的体内外生长情况.结果 成功建立了稳定表达野生型和突变型Parkin基因的Huh-7细胞株.以转染空载体的Huh-7细胞作为对照,野生型Parkin基因的表达可明显抑制肝癌细胞在体外的生长（t=3.875,P=0.031）,可显著减缓裸鼠皮下瘤的生长速度并减小其体积（t=8.228,P=0.003）.突变型Parkin基因的表达对肝癌细胞的生长影响不大（P＞0.05）.结论 野生型Parkin的重表达有助于肝癌细胞恶性表型的逆转.野生型Parkin基因是一个肝癌相关的抑癌基因.
- 陈钢施红旗单云峰沈文状朱智刘顺芳
- 关键词：肝细胞PARKIN野生型基因转染
