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国家重点基础研究发展计划(2005CB523200): 作品数：72 被引量：841H指数：12; 相关作者：步志高葛金英童光志田志军周艳君更多>>; 相关机构：中国农业科学院哈尔滨兽医研究所内蒙古农业大学华中农业大学更多>>; 发文基金：国家重点基础研究发展计划国家自然科学基金国家科技支撑计划更多>>; 相关领域：农业科学生物学医药卫生更多>>

新城疫病毒F蛋白碱裂解位点修饰及外源基因的插入对新城疫LaSota疫苗株致病力的影响被引量：7: 2008年; 新城疫是危害养禽业发展的重要传染病。新城疫病毒(NDV)具有高度传染性和高致病性,融合蛋白(F)的F1/F2裂解位点存在多个碱性氨基酸并由此形成的泛组织嗜性一直以来被认为是NDV致病的主要决定因素。本研究利用已经构建NDV弱毒LaSota疫苗株反向遗传操作平台,将LaSota病毒F蛋白的碱裂解位点由GGRQGR↓L分别突变为GRRQRR↓F和GRRQRR↓L,在未加入TPCK胰酶的情况下分别成功拯救出突变修饰LaSota疫苗病毒株rL-FmF和rL-FmL,通过测定鸡胚平均致死时间(MDT)、脑内致病指数(ICPI)和静脉内致病指数(IVPI)等指标对其毒力进行评估,结果rL-FmF和rL-FmL的ICPI值由LaSota的0.36分别上升为1.18和1.05,但MDT均大于90小时,IVPI仍然均为0,表明碱裂解位点的突变可显著增强致病力。为了检测外源基因插入对病毒致病力的影响,进一步以rL-FmF为载体,分别构建并拯救出表达H5亚型禽流感病毒血凝素HA和增强绿色荧光蛋白EGFP基因的重组病毒rL-FmF-HA和rL-FmF-EGFP,经测定ICPI分别为0.67和1.10,但MDT均大于90小时,IVPI仍然均为0。结果表明,对rLaSota病毒F蛋白裂解位点2个非碱性氨基酸突变为碱性氨基酸,无论F2蛋白氨基端为F或L,均可显著增强其脑内接种致病力,接近中发型毒株标准,但对静脉内接种致病能力均无显著影响,而对鸡胚致死能力均保持rLaSota病毒缓发型特点(MDT≥90);外源基因的重组、表达可不同程度致弱病毒,其致弱程度与外源基因及其表达产物性质有关。结果提示,影响NDV致病力不仅仅局限于F蛋白裂解位点氨基酸序列;通过F裂解位点修饰及HA基因插入可以获得致病力较高但基本接近缓发型标准的重组病毒。; 王永葛金英解希帝丁玉林步志高; 关键词：新城疫病毒裂解位点致病力

猪繁殖与呼吸综合征病毒侵入和释放依赖细胞膜胆固醇被引量：2: 2011年; 胆固醇是细胞膜脂质的重要组成成分.目前的研究发现细胞膜胆固醇在病毒的感染中扮演十分重要的作用.本研究对细胞膜胆固醇在猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)感染MARC-145细胞中的作用进行了探讨.通过TCID50检测和Real-Time RT-PCR分析发现,用胆固醇萃取剂甲基-β-环糊精预处理消除细胞膜胆固醇可显著抑制PRRSV的感染,并呈剂量依赖性;而补充外源性胆固醇后可部分恢复PRRSV的感染性,提示PRRSV感染能力的下降确实是由于细胞膜胆固醇的去除而导致的.进一步的研究证实,细胞膜胆固醇的去除对PRRSV感染性的影响主要是通过影响PRRSV的侵入和释放过程.上述结果表明,细胞膜胆固醇是影响PRRSV感染的一个重要因子.; 孙颖肖少波王荡罗锐李彬陈焕春方六荣; 关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒胆固醇

H5亚型高致病性禽流感病毒HA基因重组新城疫病毒活载体疫苗接种后气管黏膜损伤的研究被引量：2: 2010年; 为了研究H5亚型高致病性禽流感病毒HA基因重组新城疫病毒活载体疫苗[rLa Sota-HA(GD)]的免疫机理,用rLa Sota-HA(GD)免疫2日龄SPF雏鸡,分别在接种后的1,3,5,10,15,18天取气管进行电镜、光镜观察,利用免疫组化染色(IHC)方法检测病毒在气管内的分布。结果表明:接种rLa Sota-HA(GD)后第1天纤毛细胞有脱纤毛现象,杯状细胞破碎,黏液成分增多,黏膜下层的纤维裸露在表面上,并可看到纤毛细胞的纤毛上有球形粒子,杯状细胞、基细胞大量增生;接种后第18天纤毛细胞脱纤毛区域进一步增大。接种后第3天黏膜下层水肿,淋巴细胞、粒细胞、浆细胞浸润,黏膜上皮形成空泡状,表层由数层不成熟的细胞组成;接种后第10天腺体腔闭塞。免疫组化染色可见气管固有层细胞呈阳性反应,棕色颗粒出现在胞浆中。结果说明气管黏膜的损伤是机体重要的防御机制和免疫机制的表现。; 董俊斌马学恩步志高; 关键词：HA基因重组新城疫病毒

我国大陆地区PRRSV的遗传衍变分析: 自1996年我国大陆地区首次分离到PRRSV以来,该病毒相继在全国各主要养猪省份分离到,并造成了巨大的经济损失。PRRSV在不断地变异,为进一步认识我国PRRSV的分子流行病学,本研究就我国大陆地区1996年以来的PRR...; 安同庆田志军冷超良彭金美周艳君李冉童光志; 文献传递

融合表达牛疱疹病毒1型VP22及猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5重组伪狂犬病毒TK^-/gE^-/VP22 GP5^+的构建被引量：4: 2006年; To construct the bi-valent genetic engineering vaccine against pseudorabies virus（PRV）and porcine reproductive and respiratory syndrome virus（PRRSV）,the modified PRRSV ORF5 gene（ORF5M） and the VP22 gene of bovine herpesvirus 1（BHV-1）,which encodes VP22 protein and has been demonstrated to exhibit the unusual protein transduction property,were inserted into a PRV universal transfer vector pIECMV by turns.A recombinant virus transfer vector pIECMV-VP22ORF5M possessing VP22-ORF5M fusion gene was generated.The recombinant virus transfer vector pIECMV-VP22ORF5M co-transfected the IBRS-2 cells with PRV TK-/gE-/LacZ+ genomic DNA digested by EcoRⅠusing liposome method.Based on homologous recombination,the recombinant virus was generated and then purified by the plaque assay and PCR amplification.After three rounds of plaque purification,the recombinant virus was further confirmed by PCR,Southern blot and Western blot.A recombinant PRV（rPRV）TK-/gE-/VP22GP5+ expressing VP22-GP5 fusion protein was constructed.The results of TCID50 tests showed that the insertion of the foreign genes had no influence on the propagation of rPRV in IBRS-2 or PK-15 cells.The construction of rPRV TK-/gE-/VP22GP5+ provides a basis for further study of bi-valent genetic engineering vaccines against PRRSV and PRV,and that this strategy may also be useful to develop more efficient genetic engineering vaccines against other pathogens.; 赵武肖少波方六荣江云波宋云峰严琳余晓岚陈焕春; 关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒重组伪狂犬病毒

H5N1亚型禽流感病毒血凝素(HA)基因的表达及纯化被引量：9: 2008年; 利用PCR方法从含禽流感病毒HA基因的质粒T-HA上扩增HA基因,再将其克隆到原核表达载体pET28a中,用E.coliBL21(DE3)原核表达,SDS-PAGE和Western-blot对表达蛋白进行鉴定。Western-blot结果表明,表达产物具有免疫学活性,蛋白的分子量约为60kD,位于包涵体中。包涵体经变性、复性处理,表达蛋白能与H5亚型AIV阳性血清特异性反应,具有良好的抗原性。ELISA检测结果表明,用此纯化蛋白作为包被抗原检测H5N1亚型AIV血凝素抗体具有良好的灵敏性。; 李清州郝惠芳王丽赵绪永朱礼倩张丽萍邓瑞广张改平; 关键词：禽流感病毒 H5N1亚型原核表达

高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒的分离鉴定及其分子流行病学分析被引量：419: 2007年; 为了弄清2006年在我国南方一些猪场暴发的一种以高热、高发病率和高死亡率为特征的传染病的病因,我们从12个省市48个发病猪场采集临床样品进行了猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)的分离鉴定和分子流行病学分析。结果显示从48个猪场样品中均检测出了PRRSV,通过完整的ORF5和部分Nsp2基因序列比较分析发现来自12个省市不同猪场的PRRSV高度同源,而且在Nsp2基因上都有两个相同位点的缺失;从分离的15株PRRSV中选择湖南分离株HuN4人工感染5头60日龄的健康猪,结果5头猪分别在7 d～21 d内全部死亡,感染猪的临床症状和现地所见十分相似。本次试验结果表明新出现的以Nsp2基因部分缺失为特征的PRRSV对猪是高致病性的,可能是2006年大部分猪场暴发"高热综合症"的主要病因。; 童光志周艳君郝晓芳田志军仇华吉彭金美安同庆; 关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒高热综合症分子流行病学

H5N1亚型禽流感病毒HA基因重组新城疫病毒活载体疫苗株组织嗜性的研究被引量：1: 2010年; 为了研究H5N1亚型禽流感病毒HA基因重组新城疫病毒活载体疫苗株[La Sota-HAmut(GD)]的组织嗜性,用重组疫苗[La Sota-HAmut(GD)]人工感染2日龄SPF鸡,接种后定期采集病鸡的各组织器官制备成石蜡切片,用建立的检测石蜡切片中[rLa Sota-HAmut(GD)]病毒的免疫酶组化染色技术,对人工感染[rLaSota-HAmut(GD)]鸡发病后病毒的组织器官亲嗜性和动态分布规律进行研究。[rLa Sota-HAmut(GD)]在胞浆内复制,主要亲嗜气管黏膜的上皮细胞和固有层腺体细胞,肝小叶间胆管上皮细胞。病毒出现的先后顺序为气管,肝脏,肺脏。结果表明:外源基因HAmut的插入对LaSota疫苗株的组织嗜性的影响很大。; 董俊斌步志高; 关键词：组织嗜性

高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒变异株主要囊膜糖蛋白GP5的遗传变异分析被引量：18: 2008年; 为了探究高致病性猪蓝耳病病毒(HP-PRRSV)的遗传变异特征,本研究对GenBank中235株HP-PRRSV GP5序列的遗传进化、主要氨基酸基序、抗原性以及N-糖基化位点数量和位置的变异进行了分析。结果表明HP-PRRSV之间的同源性较高,与其他参考毒株相比,这些病毒处于一个相对独立的分支中,而且与经典疫苗株的亲缘关系较远。这有助于解释经典疫苗株对于HP-PRRSV为何起不到理想的免疫保护效果。在病毒的中和表位序列中存在着规律的点突变,同时抗原性比较显示HP-PRRSV与经典毒株之间存在着一定的差异。绝大多数的HP-PRRSV的N-糖基化位点在数量上多一个,而且位置要向羧基端平移2个氨基酸,从而使得中和表位两侧直接与糖链相连,可能会造成中和表位被糖侧链所遮掩,本研究由此推测减弱中和抗体对HP-PRRSV的有效识别,促进病毒逃避机体体液免疫。; 安同庆田志军肖燕姜一峰韦天超彭金美周艳君仇华吉童光志; 关键词：高致病性猪繁殖与呼吸综合征 GP5 糖基化

抗埃博拉病毒VP40蛋白单克隆抗体的制备及在抗原捕捉ELISA中的应用被引量：9: 2008年; 本研究以原核表达、纯化的扎伊尔株埃博拉病毒(Ebola virus,EBOV)VP40蛋白片段免疫BALB/c小鼠,通过杂交瘤技术制备单克隆抗体,获得一株分泌抗EBOV VP40蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞系。以重组杆状病毒表达EBOV VP40蛋白为抗原,经Western blot和间接免疫荧光检测该单克隆抗体显示出良好的特异性免疫反应。采用该株杂交瘤细胞系经腹腔注射接种8日龄BALB/c小鼠,制备腹水,并经纯化和HRP标记,获得HRP标记的抗EBOV VP40蛋白单克隆抗体。从而,初步建立一种抗原捕捉ELSIA诊断方法,以原核表达EBOV VP40蛋白片段兔抗血清为一抗,应用HRP标记的抗EBOV VP40蛋白单克隆抗体检测杆状病毒表达的重组EBOV VP40蛋白显示出良好的敏感性和特异性。结果表明,初步建立的抗原捕捉ELSIA诊断方法有希望成为一种理想的检测EBOV感染的诊断方法。; 王淑杰王喜军胡森秦立廷林祥梅步志高; 关键词：单克隆抗体

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