国家自然科学基金(30170427)
- 作品数：24 被引量：45H指数：4
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- 幽门螺杆菌空泡毒素活性检测方法的比较被引量：1
- 2003年
- 目的 分别采用细胞计数法及中性红摄入法 (NRU)检测幽门螺杆菌 (Hp)空泡毒素活性 ,探讨NRU检测空泡毒素活性的应用价值。方法 采用Hp液体培养上清浓缩液作为粗制VacA毒素 ,经倍比稀释(1∶16 0～ 1∶2 )后与胃癌SGC 790 1细胞共同孵育 2 4h。用细胞计数法及NRU同时评价VacA的空泡毒素活性 ,比较两种方法检测VacA空泡毒素活性的差异。结果 经中性红染色后 ,胃癌细胞吸收大量染料 ,空泡更加明显。NRU对空泡毒素活性的判断结果与细胞计数法基本符合 ,细胞计数法显示 1∶2 0～ 1∶2滴度样本均呈阳性结果 ,NRU于 1∶2 0～ 1∶5滴度亦得到阳性结果 ,1∶2滴度组因细胞大量死亡得到“假阴性”结果 (A550 =0 .0 6±0 .0 4 )。 1∶4 0滴度组细胞计数法判断为阴性 ,但NRU检测阳性 (A550 =0 .12± 0 .0 4 ,P <0 .0 5 )。结论 NRU检测空泡毒素活性具有简便、快速的特点 ,有助于对空泡毒素活性的定量评价 ,敏感性高于细胞计数法 。
- 苏暾杜奕奇李兆申屠振兴许国铭龚燕芳
- 关键词：幽门螺杆菌空泡毒素活性
- 以白细胞介素-2为免疫佐剂的幽门螺杆菌粘附素核酸疫苗制备及其免疫预防作用被引量：2
- 2007年
- 目的构建含幽门螺杆菌(Hp)粘附素(HpaA)基因和白细胞介素(IL)-2的核酸疫苗,体外转染COS-7细胞,鉴定其表达蛋白的免疫原性和免疫保护作用。方法应用聚合酶链反应(PCR)技术从Hp标准菌株CCUG17874基因组DNA扩增HpaA基因;从重组质粒pCIneo-IL-2扩增小鼠IL-2基因,并通过TA克隆分别克隆入pUCmT载体。检测HpaA及IL-2的核苷酸序列,酶切、连接反应将HpaA和IL-2同时克隆入真核表达载体pIRES,再经PCR法和酶切反应进行鉴定;通过脂质体法将重组载体pIRES-HpaA-IL-2转染COS-7细胞,SDS-PAGE及Western印迹法检测表达蛋白的免疫原性。重组载体转化减毒鼠伤寒沙门菌LB5000,抽提质粒,转化入SL7207,反复传代,鉴定重组核酸疫苗菌的稳定性。以该疫苗菌经口接种小鼠,4周后再用Hp攻击,鉴定感染状况。结果测序结果证实扩增的HpaA基因与Hp HpaA序列一致,IL-2序列和小鼠IL-2序列一致。PCR和酶切鉴定结果证实,HpaA和IL-2基因克隆入载体pIRES,成功构建含HpaA和IL-2基因的核酸疫苗质粒pIRES-HpaA-IL-2,Western印迹法检测到相对分子质量分别为30 000和14 000的HpaA和IL-2蛋白条带。小鼠体内实验显示HpaA-IL-2及HpaA组分别有75.0%、58.4%获免疫保护,与PBS组差异有统计学意义(P<0.01)。结论成功构建了HpaA和IL-2的Hp减毒沙门核酸疫苗菌,其免疫原性和保护性均得到证实,免疫佐剂IL-2可提高免疫保护率。
- 徐灿李兆申杜奕奇屠振兴龚燕芳许国铭
- 关键词：白细胞介素-2
- 幽门螺杆菌cagE基因与胃黏膜炎症及白细胞介素-8的关系研究被引量：2
- 2004年
- 徐灿李兆申许国铭屠振兴张乐之龚燕芳满晓华
- 关键词：胃黏膜炎症HP感染白细胞介素-8幽门螺杆菌消化性溃疡毒力因子
- 幽门螺杆菌hpaA核酸疫苗的构建及免疫原性检测被引量：3
- 2004年
- 目的构建含幽门螺杆菌(Hp)hpaA基因的核酸疫苗。方法抽提Hp标准菌株CCUG17874基因组DNA,应用聚合酶链式反应(PCR)技术从基因组DNA扩增hpaA基因,克隆入pUCmT载体,检测hpaA基因序列,经过一系列酶切、连接反应将其克隆入真核表达载体pIRES,转入大肠杆菌,筛选阳性克隆,通过PCR和酶切反应鉴定。通过脂质体法将构建好的重组载体pIREShpaA转染COS7细胞,SDSPAGE及Western印迹法检测pIREShpaA表达HpaA蛋白的免疫原性。结果成功扩增出长约750bp的hpaA基因,测序结果表明扩增出的hpaA基因与HphpaA序列一致,PCR和酶切鉴定结果证实hpaA基因克隆入真核表达载体pIRES,成功构建了含hpaA基因的Hp核酸疫苗pIREShpaA,并经Western印迹法检测到特异性蛋白条带。结论构建了hpaA基因的Hp核酸疫苗,为进一步探索其免疫作用奠定了基础。
- 徐灿李兆申屠振兴许国铭杜奕奇孙波杨骅龚燕芳金晶吴红玉
- 关键词：HPAA基因IRES核酸疫苗WESTERN印迹法幽门螺杆菌
- 幽门螺杆菌液体培养的研究
- 2002年
- 目的 :建立一种适用于幽门螺杆菌 (Hp)大量扩增并提取致空泡变性细胞毒素 (Vac A)的液体培养方法。 方法 :采用TSB及 MHB培养液 ,加入小牛血清 (FBS)或环糊精 (CD)作为支持剂 ,比较其对 Hp的扩增效果及上清中空泡毒素活性的差异。结果 :TSB+CD组 Hp平均扩增速度及菌体湿重与 TSB+FBS组相比无显著差异 ,二者均显著高于 MHB培养液组 (P<0 .0 1)。 TSB+CD组上清蛋白浓度为 (2 .4 4± 0 .39) m g/ m l,显著高于 MHB+CD组。 TSB培养液组浓缩上清具有明显的空泡毒性 ,且蛋白电泳可见相对分子质量为 95 0 0 0的 Vac A,而 MHB培养液组无空泡毒性。 结论 :以 TSB为培养液 ,加入适量的CD作为支持剂 ,在不损失 Vac A活性的前提下 ,可明显增加浓缩上清液中的蛋白纯度 ,是大量提取和制备 Hp Vac A蛋白理想的液体培养方法。
- 杜奕奇许国铭屠振兴李兆申龚燕芳
- 关键词：幽门螺杆菌
- 幽门螺杆菌VacA毒素的初步纯化被引量：1
- 2002年
- 杜奕奇李兆申屠振兴蒋应明许国铭龚燕芳
- 关键词：幽门螺杆菌纯化
- 幽门螺杆菌空泡毒素活性的体外观察被引量：5
- 2005年
- 目的研究幽门螺杆菌(Hp)液体浓缩上清液对胃上皮细胞的空泡毒性作用,为进一步开展空泡变性细胞毒素(VacA)的纯化及探讨VacA的致病机制奠定基础。方法将Hp菌株液体培养上清液制成粗制VacA蛋白,粗制VacA经倍比稀释(1∶160～1∶2)后与胃癌SGC7901细胞共同孵育后观察胃癌细胞形态变化,同时观察1∶2及1∶5滴度组于0、2、4、8、16和24h时的空泡活性。采用中性红摄入法(NRU)评价空泡活性。结果1∶2及1∶5滴度组胃癌细胞于24h时空泡形成细胞达100%,空泡细胞比例随毒素滴度递减。孵育24h时粗制VacA产生空泡活性的最小剂量约为6μg,超过120μg可导致细胞死亡。当毒素滴度为1∶2时,孵育4h即产生明显空泡[550nm光吸收值(A550)=0.43±0.06],至16h达最高吸收值(A550=0.71±0.03),至24h时因细胞大量死亡,A550反而下降至0.06±0.04,与空白对照组的差异无显著性(P>0.05)。1∶5毒素滴度的时间曲线较1∶2滴度更恰当反映出空泡活性随孵育时间变化的特性。结论Hp液体培养上清浓缩液对胃癌细胞具有明显的空泡毒性作用,VacA导致的空泡毒性具有明显的浓度及时间依赖性,且易受多种因素的影响,适当的浓度及孵育时间是VacA致病机制研究过程中的关键因素。
- 杜奕奇李兆申苏暾屠振兴龚燕芳
- 关键词：幽门螺杆菌空泡毒素
- 幽门螺杆菌中性粒细胞激活蛋白的表达及免疫原性被引量：1
- 2006年
- 目的克隆幽门螺杆菌(Hp)中性粒细胞激活蛋白(NAP)基因并制备其原核表达系统,研究其表达蛋白的免疫原性,为Hp疫苗研制提供理论依据。方法采用聚合酶链反应(PCR)扩增Hp-NAP基因,测序并作同源性分析后,亚克隆入原核表达载体pET-22b,转化表达菌BL21-CodonPlus(r)(DE3),IPTG诱导表达,SDS-PAGE分析,Western blot鉴定其免疫原性。结果PCR扩增一408 bp产物,与基因库中相关序列具有高度同源性(>98%)。重组质粒pET-22b-nap转化BL21-CodonPlus(r)(DE3)后表达一相对分子质量约19 000的融合蛋白,能与Hp全菌抗体产生结合反应,Western blot显示特异的单一条带。结论成功构建Hp-NAP原核表达系统,所表达NAP融合蛋白具有良好的免疫原性和免疫反应性,可作为Hp疫苗的候选抗原。
- 孙波杨骅许涛李兆申屠振兴杜奕奇许国铭
- 关键词：螺杆菌中性粒细胞激活蛋白疫苗
- 幽门螺杆菌中性粒细胞激活蛋白核酸疫苗实验研究被引量：2
- 2004年
- 目的 构建幽门螺杆菌(Hp)中性粒细胞激活蛋白(Hp -NAP)口服DNA疫苗,初步评价其免疫治疗作用,为Hp疫苗研制奠定基础。方法 PCR扩增全长Hp- NAP基因(napA) ,测序并同源性分析后,亚克隆入真核表达载体pIRES ,双酶切并PCR鉴定。将重组质粒pIRES- napA转化减毒鼠伤寒沙门菌SL72 0 7,口服接种长期感染Hp之BALB/c小鼠,观察疗效。结果 PCR扩增出一4 35bp产物,序列分析表明,所克隆序列与GenBank中SS1 napA核苷酸及蛋白质同源性均>98%。PCR及双酶切证实,成功构建了携带napA的重组减毒鼠伤寒沙门菌DNA疫苗。疫苗接种后4周,治疗组3/ 4小鼠快速尿素酶检测阴性,对照组均阳性(P =0 .0 4 76 ) ;治疗组血清抗Hp NAP抗体效价明显升高。结论 成功构建了具有较好免疫治疗作用的Hp -NAP口服重组DNA疫苗,为进一步研制多价抗HpDNA疫苗奠定了基础。
- 孙波杨骅李兆申龚燕芳屠振兴许国铭
- 关键词：中性粒细胞激活蛋白NAP减毒鼠伤寒沙门菌亚克隆PCR扩增
- 携带幽门螺杆菌尿素酶B亚单位的重组减毒鼠伤寒沙门菌核酸疫苗的构建被引量：2
- 2005年
- 目的 构建含幽门螺杆菌(Hp)尿素酶B亚单位(ureB)基因重组减毒鼠伤寒沙门菌核酸疫苗。方法 抽提Hp标准菌株CCUG17874基因组DNA,应用聚合酶链反应(PCR)技术从基因组DNA扩增ureB基因,克隆入pUCmT载体,检测ureB基因序列,经过酶切、连接反应将其克隆入真核表达载体pIRES,转入感受态大肠杆菌DH5α,筛选阳性克隆,通过PCR和酶切反应进行鉴定。重组载体pIRES ureB转入减毒鼠伤寒沙门菌LB5000,抽提质粒,再次转入SL7207,反复传代,鉴定重组核酸疫苗菌的稳定性。通过脂质体法将构建好的重组载体pIRES ureB转染COS 7细胞,SDS PAGE Western 印迹法检测pIRES ureB表达蛋白的免疫原性。结果 扩增出长约1700 bp的ureB基因,测序结果表明扩增出的ureB基因与基因库Hp ureB序列一致,PCR和酶切鉴定结果证实ureB基因克隆入真核表达载体pIRES,并成功构建了Hp ureB基因的减毒鼠伤寒沙门菌核酸疫苗,重组核酸疫苗稳定,并且Western印迹法检测到特异性的蛋白条带。结论 构建了具有免疫反应性的Hp UreB减毒鼠伤寒沙门菌核酸疫苗,为进一步探索其体内的免疫作用奠定了基础。
- 徐灿李兆申屠振兴杜奕奇龚燕芳金晶满晓华孙波杨哗许国铭
- 关键词：减毒鼠伤寒沙门菌幽门螺杆菌尿素酶B亚单位WESTERN印迹法COS-7细胞DNA扩增免疫反应性
