浙江省医药卫生科学研究基金(2008A056)
- 作品数：7 被引量：16H指数：2
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- 相关机构：浙江大学医学院附属第一医院咸宁学院华中科技大学更多>>
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- 大鼠耳蜗螺旋神经节细胞的定量观察被引量：4
- 2011年
- 目的为定量观察SASCO Sprague Dawley(SD)大鼠耳蜗蜗轴螺旋管(Rosenthal's canal)切片中螺旋神经节细胞的数量提供实验依据。方法 11只SD大鼠用于本实验研究,其中5只正常SD大鼠用于对照,另外6只SD大鼠用于制备乌苯苷引起的螺旋神经节细胞损害模型。耳蜗样品制作耳蜗中轴半薄切片,常规甲苯胺蓝染色,对耳蜗各回蜗轴螺旋管内的螺旋神经节细胞进行计数,计数结果采用方差分析检验。结果一个完整蜗轴螺旋管内的螺旋神经节细胞数量在底回末段多于耳蜗底回起始段和中回中段。与正常大鼠耳蜗螺旋神经节数量相比,1mM乌苯苷仅造成耳蜗底回的部分螺旋神经节细胞破坏,而10mM乌苯苷可破坏绝大部分螺旋神经节,乌苯苷引起的螺旋神经节破坏模式是从耳蜗底回逐渐向顶回发展。结论计数耳蜗各回不同部位切片中的蜗轴螺旋管内螺旋神经节细胞数量是一种简便可靠的耳蜗螺旋神经节细胞定量分析方法。
- 付勇丁大连Richard Salvi
- 关键词：螺旋神经节细胞
- 大鼠耳蜗疆孔内听神经纤维的定量观察被引量：2
- 2010年
- 目的探讨定量观察正常SD大鼠疆孔内听神经纤维数量的方法。方法取5只正常SD大鼠耳蜗(正常组),EPON812包埋后,沿蜗轴平面作半薄切片,甲苯胺蓝染色后光镜下观察拍照,用Adobe Photoshop图像处理软件处理图像,并采用计数单个完整疆孔内神经纤维数量均值及疆孔内神经纤维密度均值的方法分别对耳蜗底回起始段、底回末段及中回中段疆孔内的听神经纤维进行计数,对耳蜗各部位听神经纤维数目的差异进行方差分析。以同法对5只乌苯苷耳中毒SD大鼠(耳中毒组)疆孔内听神经进行了定量观察,以验证此法的实用性。结果正常SD大鼠疆孔内的神经纤维数量在耳蜗底回起始段、耳蜗底回末段、耳蜗中回中段分别为22.78±7.15、130.12±50.73、58.66±9.12根,各部位的差异有显著统计学意义(F=195.15,P<0.01);疆孔内听神经纤维密度(104根/mm2)在底回起始段、底回末段、中回中段分别为7.17±1.51、23.95±2.73、15.95±2.26,在底回末段的疆孔内神经纤维的数量多于耳蜗底回起始端和耳蜗中回中段(F=804.86,P<0.01)。耳中毒组耳蜗底回起始段、末段和耳蜗中回中段疆孔内神经纤维数量分别为13.63±12.34、80.69±24.42、54.94±8.79根,神经纤维密度(104根/mm2)分别为2.06±1.53、15.94±2.26、15.68±2.52,其中,耳蜗底回起始段和末段均明显少于相应的正常组(P<0.01)。结论采用疆孔内神经纤维密度均值定量观察疆孔内听神经纤维的数量,其结果可靠且更稳定。
- 付勇丁大连Richard Salvi
- 关键词：神经纤维
- 耳后进路大鼠耳蜗中阶侧壁显微注射携带EGFP慢病毒的实验研究被引量：2
- 2010年
- 目的探讨经大鼠耳后进路耳蜗中阶侧壁导入携带增强型绿色荧光蛋白(EGFP)慢病毒的实验可行性,为后续携带目的基因慢病毒治疗大鼠感音神经性聋的实验打下基础。方法大鼠经耳后进路,耳蜗中阶侧壁开孔,显微注射携带EGFP慢病毒液或人工内淋巴液。术后3周,处死动物取耳蜗,行耳蜗冰冻切片,荧光显微镜下观察携带EGFP慢病毒的表达情况。术前和术后3周动物处死前,行听性脑干反应(ABR)检测其听功能改变。结果术中、术后动物一般情况好。EGFP可见在耳蜗中阶血管纹边缘细胞、Corti器、螺旋神经和螺旋神经节细胞内表达。术后实验组大鼠手术耳ABR阈值提高(55.8±4.9)dBSPL。结论大鼠经耳后进路,耳蜗中阶侧壁开窗,可将慢病毒携带的EGFP基因导入,并在耳蜗中阶Corti器表达。
- 潘松付勇刘杰刘立思
- 关键词：耳后进路慢病毒显微注射增强型绿色荧光蛋白
- Math1基因重组慢病毒的构建及其在293T细胞中的表达被引量：2
- 2011年
- 目的构建携带Math1基因的重组慢病毒载体,检测其滴度,检测其在293T细胞中的表达。方法 PCR扩增Math1基因,将其连入慢病毒载体pLenti-GFP中;在感受态细胞DH5α中培养扩增,并行Math1基因的测序鉴定;将重组的慢病毒四质粒共转染293T细胞,收获并浓缩病毒;感染293T细胞和提取细胞DNA后用实时定量PCR法检测病毒滴度。用逆转录PCR和Western blot法检测Math1基因在感染病毒的293T细胞中的表达。结果构建的慢病毒载体pLenti-Math1-GFP经测序分析证实基因序列正确。四质粒共转染293T细胞后,荧光显微镜下可见大量绿色荧光。包装后慢病毒测定滴度约为3×1011Tu/L。逆转录PCR和Western blot法均能检测Math1基因在感染病毒的293T细胞中的表达。结论成功构建携带Math1基因的重组慢病毒,并能在293T细胞中表达。
- 潘松付勇刘强刘立思刘杰
- 关键词：MATH1慢病毒293T细胞
- 胚胎大鼠神经干细胞的冷冻及复苏被引量：2
- 2010年
- 目的:研究胚胎大鼠神经干细胞(NSCs)冻存复苏后的存活率及再培养生长情况,观察低温冻存对NSCs生物特性的影响。方法:含有10%BSA及7.5%DMSO的NSCs无血清培养液(不含神经生长因子)作为冻存液,将利用无血清培养液体外培养的原代、第3代、第6代胚胎大鼠NSCs进行冻存,于1周、4周、8周、12周、16周分别复苏,计数活细胞比例并进行再培养、分化鉴定。结果:不同的细胞代数,不同的冻存时间对复苏后的细胞存活率都无明显影响。复苏后NSCs的存活率均达到60%～70%,并能分化为神经元和星型胶质细胞。结论:本实验成功地对胚胎大鼠NSCs进行了冻存复苏及再培养,为择期应用NSCs耳蜗内移植治疗感音神经性聋的实验研究奠定了基础。
- 付勇潘松刘强龚树生
- 关键词：神经干细胞胚胎冻存
- 胚胎大鼠海马源性神经干细胞的分离、培养、分化和鉴定被引量：2
- 2011年
- 目的:探讨胚胎大鼠海马源性神经干细胞(N SC)的分离、培养、分化和鉴定的方法。方法:机械分离出胚胎大鼠海马区细胞,以无血清培养基培养,再以血清培养基诱导其分化;在显微镜下观察其形态学特征,逆转录PCR(RT-PCR)和免疫荧光化学法检测神经干细胞和其诱导后细胞的表面标志物。结果:无血清培养基条件下培养的细胞在光镜下可见呈悬浮生长,易聚集成神经球,RT-PCR和免疫荧光化学法可检测到N SC表面标志物N estin的表达;经血清培养基诱导分化后,光镜下可见细胞呈贴壁生长,可见胞体呈树突状突起或呈梭形,RT-PCR和免疫荧光化学法可检测到星形胶质细胞的表面标志物GFAP和神经元细胞的表面标志物N SE的表达。结论:胚胎大鼠海马区分离的细胞具有N SC的特性,并能在含特定生长因子的无血清培养基保持其分化潜能,为进一步针对N SC的研究奠定了基础。
- 潘松付勇刘强刘杰刘立思
- 关键词：细胞分离细胞培养干细胞海马胚胎
- 大鼠耳蜗器官培养及其组织学检查技术被引量：6
- 2009年
- 目的探讨大鼠耳蜗器官体外培养的方法和观察毛细胞、神经纤维及螺旋神经节细胞的组织学检查技术。方法将出生3天的SASCO Sprague Dawley大鼠耳蜗取出平铺培养。应用神经丝免疫组织化学方法对螺旋神经节细胞及神经纤维染色,同时应用鬼笔环肽染色特异性显示耳蜗毛细胞的静纤毛和表皮板。在共聚焦显微镜下应用不同的激发荧光分别显示耳蜗毛细胞、螺旋神经节和神经纤维。结果耳蜗器官经1～3天离体培养,内、外毛细胞生长良好,无衰亡和缺损;神经纤维排列有序;螺旋神经节细胞形态正常。结论本文介绍的耳蜗器官体外培养方法和组织学检查指标,将在常规评估耳蜗毛细胞、螺旋神经节细胞和神经纤维的离体培养损害实验模型中,有一定应用价值。
- 付勇丁大连Richard Salvi
- 关键词：动物耳蜗细胞
