国家自然科学基金(30170401)
- 作品数：14 被引量：62H指数：4
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- 苯并芘对γ谷氨酰半胱氨酸合成酶调控作用的初步研究被引量：1
- 2006年
- 目的分析苯并芘(B(a)P)对γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-GCS)催化亚单位(GCLC)基因的调控作用。方法用超级凝胶滞留实验(Supershift)确认苯并芘(B(a)P)刺激能诱导芳香烃受体核转位因子(ARNT)或其复合物与大鼠GCLC上游调控序列中的E-box元件结合。在不同浓度苯并芘刺激下,在体外通过萤火虫荧光素酶报道系统比较大鼠GCLC5′端全长调控序列及缺失E-box位点的5′端全长调控序列的功能变化,初步确定苯并芘的调控作用。结果B(a)P刺激能够使ARNT或复合物结合E-box元件。用不同浓度的B(a)P于不同的时间点检测,CCL-149细胞荧光素酶活性改变不大(P>0·05)。结论B(a)P刺激能使ARNT与γ-GCS基因上的E-box结合,但这种结合似乎对γ-GCS基因上游调控序列基因的功能影响不大。
- 熊丽红李冰冉丕鑫
- γ-GCS基因抑制元件E-box的实验研究被引量：4
- 2005年
- 目的 明确大鼠肺泡上皮细胞γ谷氨酰半胱氨酸连接酶催化亚单位编码基因(GCLC基因)负调控区域( -745^-705)上的功能元件E box作用。方法 利用迁移率变动试验(EMSA)和超级迁移率变动试验证实大鼠肺泡上皮细胞GCLC基因负调控区域的E- box元件能与转录因子USF1 /USF2特异性的结合;通过共转染USF1 /USF2表达质粒(pCMV -USF1 /pCMV- USF2)和GCLC -luc确认E- box元件在基因调控中的作用;最后通过构建USF1 /USF2的逆转录病毒载体,将表达USF1 /USF2的重组逆转录病毒感染肺泡上皮细胞, 用Western印迹检测细胞GCLC蛋白表达受影响的情况,进一步确定E box元件与USF作用在GCLC基因表达中的最终作用。结果 EMSA和超级迁移率变动试验证实GCLC基因负调控区域的功能元件是E- box,且该元件与USF特异结合参与GCLC基因的调控;共转染USF1 /USF2表达质粒的细胞GCLC基因表达明显下降;Western印迹证实感染重组USF1 /USF2逆转录病毒使肺泡上皮细胞的GCLC蛋白表达明显下降。结论 E -box元件通过与转录因子USF作用抑制GCLC基因表达,E box元件是γGCS基因的重要的抑制元件。
- 程璘令李冰涂洪斌刘启才冉丕鑫
- 关键词：共转染WESTERN印迹EMSA调控区功能元
- 香烟烟雾凝聚物通过AP-1探针调节肺泡上皮细胞γ-GCS限速酶的表达被引量：1
- 2005年
- 目的探讨香烟烟雾凝集物(CSC)对肺泡上皮细胞(CCL149)表达限速酶r-GCS的影响与机制。方法用不同浓度的CSC处理CCL149细胞1、4、8、12、24、48 h后,采用反向聚合酶链反应和W est印记法在CSC作用不同时间点检测CCL149细胞表达r-GCS的mRNA和蛋白的水平;脂质体转染及荧光素酶活性检测法测定CSC对大鼠gamm a-GCS重链(GCLC)基因5′-端启动子区域功能的影响;用EMSA法测定AP-1探针的结合水平。结果CSC可刺激CCL-149细胞表达gamm a-GCS,在一定浓度时(>1μg/m l),CCL149细胞用CSC处理后1、4、8 h组-γGCS mRNA的表达水平未见到有明显的差别;而12、24、48 h组-γGCS mRNA的表达水平较对照组明显增高(1.71±0.12 vs.0.67±0.06,P<0.05)。CSC亦能使带有GCLC 5′-端全长的荧光素酶报道基因的荧光素酶的活性增强,与无启动子的空载体对照组比较,CSC刺激后12、24、48 h组荧光素酶的活性均明显增强,其γ-GCS的活性均有升高(0.63±0.24 vs.1.75±0.27,P<0.05)。CSC尚促进AP-1与GCLC的DNA结合水平。结论CSC通过激活氧化应激敏感的转录因子AP-1上调CCL-149细胞内r-GCS的表达。
- 邹朝霞冉丕鑫
- 关键词：烟草肺泡
- 吸烟对大鼠肺内谷胱甘肽与γ-GCS的影响及乙酰半胱氨酸的干预作用被引量：10
- 2007年
- 目的:探讨被动吸烟对SD大鼠BALF中谷胱甘肽浓度(GSH)和肺组织中γ-GCS表达的影响以及乙酰半胱氨酸NAC的干预作用。方法:SD大鼠被分成吸烟、吸烟同时加用NAC和单纯吸烟3组,分别采用GSH特异性的DTNB-GSH还原酶循环法及免疫组化的方法检测GSH浓度及γ-GCS的表达水平。结果:单纯被动吸烟大鼠肺BLAF中GSH水平较对照和加用NAC组明显升高(P<0.05)。肺组织内γ-GCS阳性染色明显增强;吸烟与吸烟同时服用NAC组比较没有显著区别(P>0.05)。结论:被动吸烟促进SD大鼠肺内GSH和γ-GCS表达,这可能是机体的一种自我代偿反应;NAC对吸烟导致的气道炎症具有一定的保护作用。
- 邹朝霞何志义冉丕鑫
- 关键词：吸烟谷胱甘肽
- 转录因子上游刺激因子在大鼠不同组织中的分布被引量：2
- 2010年
- 目的：探讨转录因子上游刺激因子（USF）在大鼠不同正常组织中的分布情况.方法：使用大鼠多种组织构成的组织芯片,免疫组织化学检测USF1、USF2在各组织及其细胞中的表达.结果：USF是体内广泛分布的转录因子,除血管内皮、肾小球细胞外在大多数上皮细胞有强的表达.在肌肉组织主要表达于骨骼肌和心肌组织,平滑肌则只有USF2表达;结缔组织中,表达阴性或弱阳性;在卵巢组织中,USF1在发育卵泡和闭锁卵泡均为强阳性表达,USF2则在闭锁卵泡中,强阳性表达,在发育卵泡则表达较弱.结论：USF是大鼠体内广泛分布的转录因子,可能参与调控一般细胞生理活动的基因表达.
- 邹东霆李冰付欣洪玮周问渠冉丕鑫
- 关键词：转录因子免疫组织化学
- 红霉素干预对烟雾暴露大鼠肺部炎症的影响被引量：3
- 2005年
- 何志义彭公永于亮钟南山冉丕鑫
- 关键词：红霉素肺部炎症
- 大蒜素对大鼠肺泡上皮细胞γ谷氨酰半胱氨酸合成酶表达的影响被引量：5
- 2006年
- 目的观察大鼠肺泡上皮细胞(CCL149细胞系)谷胱甘肽(GSH)、丙二醛(MDA)及γ谷氨酰半胱氨酸合成酶(γGCS)等表达变化,了解大蒜素对CCL149细胞抗氧化能力的影响。方法在以四甲基偶氮唑盐(MTT)法确定大蒜素适当作用浓度的基础上,用不同浓度大蒜素(0、0.1、1.0、5.0μg/ml)作用CCL149不同时间(6、12、24、48h),用分光光度法检测细胞内GSH、MDA的变化;用Westernblot法检测细胞内γGCS蛋白的表达,分析不同处理剂量、不同处理时间大蒜素对细胞内GSH、MDA及γGCS的影响。结果(1)大蒜素浓度≤5μg/ml不影响细胞活力。(2)大蒜素0.1、1.0、5.0μg/ml组在处理6h后细胞内GSH含量[6h组GSH含量分别为(16.45±0.69)、(16.81±0.79)、(17.80±1.10)mg/g蛋白]较对照组[(13.38±1.16)mg/g蛋白]显著增加(t=3.92～4.78,P均<0.05),MDA含量[(1.07±0.02)、(1.02±0.06)、(1.00±0.05)nmol/mg蛋白]较对照组[(1.23±0.05)nmol/mg蛋白]下降(t=5.75～6.34,P均<0.05)。细胞内GSH水平升高至24h达顶峰,48h有所下降,仍较对照组高,相同时间点不同大蒜素浓度组分别与对照组比较,差异均有统计学意义(P均<0.05)。(3)大蒜素0.1、1.0、5.0μg/ml组在刺激6、12、24h细胞内γGCS蛋白表达(24h为0.693±0.027、0.646±0.081、0.667±0.077)较对照组(0.531±0.007)显著增强(t=2.82～9.92,P<0.05),各观察指标未呈现剂量依赖性。结论大蒜素能增强大鼠肺泡上皮细胞的抗氧化作用,可能与其促进γGCS的表达有关。
- 熊丽红于亮李冰冉丕鑫
- 关键词：谷胱甘肽丙二醛大蒜素大鼠肺泡上皮细胞
- GCLC基因上游AHR/ARNT元件负性调控GCLC基因在大鼠支气管上皮细胞的表达被引量：1
- 2009年
- 研究谷氨酰半胱氨酸合成酶催化亚单位(GCLC)基因上游调控序列中2个AHR/ARNT元件的功能,从而了解γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-GCS)基因转录调节特征.分别构建缺失2个位点AHR/ARNT元件的GCLC基因上游近端序列的萤光素酶报道基因载体以及含有2个AHR/ARNT元件核心序列的萤光素酶报道基因载体.转染大鼠支气管上皮细胞(RTE),比较检测野生与缺失报道载体的基因转录调控效率;利用电泳迁移率变动实验(EMSA)和超级迁移率变动实验检测AHR/ARNT元件与AHR以及ARNT因子的特异性结合;通过转染AHR因子真核表达质粒进一步确定AHR/ARNT元件与AHR结合在GCLC基因表达中的最终作用.结果显示,相比其野生序列,缺失AHR/ARNT元件(-1 090^-1 085)和双缺失AHR/ARNT元件(-1 090^-1 085,-215^-210)的GCLC上游调控序列报道载体在RTE显著提高萤光素酶表达(均P<0.05),而缺失AHR/ARNT元件(-215^-210)则未见显著影响(P>0.05);独立AHR/ARNT元件(-1 090^-1 085)具有转录促进作用(P<0.05)而独立AHR/ARNT元件(-215^-210)无明显影响(P>0.05).转染CMV2-AHR能够抑制野生型和缺失型报道载体的萤光素酶表达(P<0.05).EMSA证实GCLC基因上游调控区域的2个AHR/ARNT元件均有核蛋白结合,并且超级迁移率变动实验显示结合的蛋白主要含有转录因子AHR以及ARNT.因此,2个AHR/ARNT元件均可以与异源二聚体AHR/ARNT结合,AHR/ARNT元件(-1 090^-1 085)是GCLC基因中重要的抑制元件.
- 赖宁李冰王健付欣洪玮冉丕鑫
- 关键词：转录调控
- 红霉素对过氧化氢刺激的支气管上皮细胞表达白细胞介素-8与谷胱甘肽的影响被引量：17
- 2005年
- 目的探讨红霉素对过氧化氢(H2O2)诱导的支气管上皮细胞表达炎症介质白细胞介素8(IL8)及抗氧化剂谷胱甘肽(GSH)的影响和可能的作用机制。方法培养16HBE株的人支气管上皮细胞,应用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法观察过氧化氢及红霉素对细胞生长的影响。将传代后的细胞按24、36、48h3个时间段分组,每个组再分为对照组、H2O2组、红霉素+H2O2组。通过酶联免疫吸附实验检测细胞上清中IL8的浓度;通过凝胶迁移率阻滞实验(EMSA)来检测转录因子核因子κB(NFκB)和激活蛋白1(AP1)的活性;通过酶联免疫检测仪检测细胞内GSH、谷氨酰半胱氨酸合成酶(γGCS)的含量;应用Western印迹检测谷氨酰半胱氨酸合成酶重链亚单位(γGCSHS)蛋白表达。结果红霉素(5μg/ml)预孵育36、48h后可以抑制H2O2(0.01mmol/L)诱导的HBE上清中IL8的含量;红霉素(5μg/ml)预孵育36、48h后可以下调H2O2(0.01mmol/L)诱导的支气管上皮细胞转录因子NFkB、AP1的活性;红霉素(5μg/ml)预孵育48h抑制H2O2(0.01mmol/L)诱导的HBE细胞GSH和γGCS的含量(3.46±0.41)以及γGCSHS蛋白表达、γGCSHS启动子区域AP1转录活性。结论红霉素通过下调NFκB、AP1的活性而抑制H2O2诱导的炎症介质IL8的释放,进而影响GSH及γGCS的合成调控。
- 何志义邹朝霞于亮钟南山冉丕鑫钟小宁
- 关键词：过氧化氢细胞表达红霉素转录因子NF-KB四甲基偶氮唑蓝
- E-box元件对大鼠γ-GCS催化亚单位基因调控作用的组织特异性研究被引量：4
- 2007年
- 目的:探讨大鼠γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-GCS)催化亚单位(GCLC)基因启动子(-745～-705)区段E-box元件对其转录调控是否存在组织细胞差异性。方法:分别将GCLC5’端上游序列驱动的荧光素酶报道基因载体GCLC-Luc、E-box缺失的delE-box-GCLC-Luc及pGL3-enhancer空载体瞬时转染大鼠不同组织来源的细胞,测得荧光素酶活性;并经蛋白定量及pSV-β-半乳糖苷酶的活性测定,获得校正荧光素酶活性值,通过比较校正荧光素酶活性值差异间接判断E-box元件对GCLC转录活性的影响。结果:在大鼠心肌细胞H9C2(2-1),转染delE-box-GCLC-Luc组荧光素酶活性值较转染GCLC-Luc组明显升高(P<0.001),说明E-box能使其GCLC转录活性下调;在大鼠肾小球细胞HBZY-1,转染delE-box-GCLC-Luc组荧光素酶活性值较GCLC-Luc组明显降低(P<0.02),提示E-box具有上调该细胞GCLC转录活性的作用;而在大鼠神经胶质瘤细胞C6和小肠隐窝上皮细胞IEC-6,组间差异无统计学意义(P>0.05),提示E-box对其GCLC转录活性无影响。结论:E-box元件能组织特异性的调控大鼠GCLC基因的转录,该元件可能是决定GCLC基因存在组织差异性表达的重要顺式作用元件。
- 陈辉李冰冉丕鑫
- 关键词：Γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶氧化应激
